第五章病毒感染的检测与防治
病毒感染：指病毒侵⼊体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发⽣相互作⽤的过程。 病毒侵⼊机体是否引起发病，主要取决于病毒的毒⼒和宿主的抵抗⼒（包括特异性和⾮特异性免疫因素），⽽且⼆者的相互作⽤受到外界各种因素的影响。
为什么对于病毒性疫病，“重在预防”⽽⾮？迄今，对病毒感染的药物效果远不如抗⽣素等对细菌感染的疗效，因此对病毒感染的诊断与预防⼯作显得尤为重要。
第⼀节病毒感染的检测
病毒检测对于病毒研究和病毒病的诊断⼗分重要。动物病毒性疾病的确诊通常必须依赖于实验室的检测。动物病毒感染的实验室检测（病毒学诊断）通常有三种⽅法：
①病毒的分离与鉴定（最经典的⼿段，要实现对病毒的分离，具体还包括病料的采集和准备、接种与培养；对分离病毒的鉴定具体来讲还包括形态学观察、理化特性测定、⾎清学、动物回归实验、分⼦⽣物学鉴定等基本过程。） 除对病毒作分离与鉴定外，动物病毒感染的实验室检测⽅法还包括：
②病毒的⾎清学检测（基于病毒抗原与宿主所产⽣的相应抗体的特异性免疫应答。可⽤已知特异性抗体检测感染细胞或组织中的病毒蛋⽩，也可检测宿主体内对病毒感
染所产⽣的特异性抗体）；
③病毒核酸的检测（分⼦检测，可以
检测感染细胞或组织中的具有特定序列的
病毒核酸⽚段）。
临床诊断应根据流⾏病学资料、疾病
河南天价过路费案的症状与体征综合判断可能为何种病毒感
染，留取适宜的标本送检。
⼀、病毒的分离和鉴定
病毒的检测通常有助于病毒病的诊断，特别是对于新发病毒性传染病⽽⾔，尤其重要。
病毒的分离鉴定包括：病毒材料的采集与准备、病毒的分离与培养、病毒的形态学观察，病毒的理化特性测定、病毒的⾎清学鉴定、动物回归实验及病毒的分⼦⽣物学鉴定等基本过程。病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接的病原学证据，同时可为进⼀步的病毒学研究提供材料。但⽅法复杂、要求严格且需较长时间，故不适合临床诊断，只适⽤于病毒的实验室研究或流⾏病学调查。
1、病料的采取与准备
病料采集适当与否，直接影响病毒的检测结果。⼀般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等，采样因动物及病毒的种类⽽异。例如，腹泻幼⽝或犊⽜，⼀般应采集粪样，检测⽝细⼩病毒或轮状病毒。怀疑为⼝蹄疫的猪或⽜，则应采其⽔泡液及⽔泡⽪检测。
病料采取送检的注意事项：
①.尽早采取在发病初期（急性期）采取，较易检出病毒，越迟阳性率越低。
②.部位适宜由感染部位采取，如呼吸道感染采取⿐咽洗漱液或咯痰；肠道感染采取粪便；脑内感染采取脑脊液；⽪肤感染采取病灶组织；有病毒⾎症时采取⾎液。
③.某些病毒在室温中容易失去活性，相关病料应低温保存并尽快送检。若距离实验室较远，应将检材放⼊装有冰块或⼲冰的空器内送检。
④.检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份⾎清，以便对⽐双份⾎清抗体效价的动态变化。第⼀份尽可能在发病后⽴即采取，第⼆份在发病后2～3周采取。⾎清标本放4℃～20℃保存，试验前⾎清标本以56℃ 30分钟处理去除⾮特异性物质及补
体。
病毒检材采集与检验结果的关系
采取标本的时期检查病毒及其成分测定抗体
潜伏期及前驱期刚发病或急性期恢复期及康复期较难查见
最多查见
很难查见
未增多
未增多或增多不明显
明显增多（常超过4倍）
⑤.采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前，都需要作适当的处理，以保证病毒分离的成功⼏率。
⽆菌标本(脑脊液、⾎液、⾎浆、⾎清)可直接接种细胞、动
物、鸡胚；
采集的器官或组织样本，如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等，
可取⼀⼩块进⾏充分研磨，加⼊含青、链霉素的Hanks液，离⼼
取上清液作为接种物；
⿐液、脓汁、乳液汁等分泌物或渗出液、粪便，应加⼊⾼浓度的抗⽣素，充分混匀后，置4℃冰箱内处理2～4h或过夜，离⼼后取上清作接种⽤；
取样后，应迅速将咽喉拭⼦浸泡⼊含有2％犊⽜⾎清和⼀定浓度的青、链霉素的Hanks 液中，充分涮洗棉拭⼦，反复冻融3～5次，离⼼后取上清液作为接种材料。
2、病毒的分离与培养
细胞培养、禽胚培养和动物接种可⽤于病毒的分离与培养，其中细胞培养是⽤于病毒分离与培养最常
⽤的⽅法。采⽤细胞培养进⾏病毒分离时，应盲传3代，观察细胞病变，如仍不出现细胞病变，⽤分⼦⽣物学⽅法检测为阴性者，可判为阴性结果，中⽌传代。
①、动物接种
这是最原始的病毒分离培养⽅法。常⽤⼩⽩⿏、⽥⿏、豚⿏、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性⽽定，可接种⿐内、⽪内、脑内、⽪下、腹腔或静脉，例如嗜神经病毒（脑炎病毒）接种⿏脑内。接种后逐⽇观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。
优点：⽅法简单；可测定病毒的致病性；可⽤于⽆法通过鸡胚或细胞培养的病毒。
缺点：动物的品质、个体差异性、体液因素等，以及可能携带病原体等，会直接或间接地⼲扰研究结果和⽣物制品的质量。
②、禽胚培养
禽胚是正在发育的活体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，且
对多种病毒敏感，可⽤于病毒的分离、鉴定、研究，抗原的制备等。
引起禽类疫病的病毒及流感病毒，经常采⽤9～11⽇龄的鸡胚。
鸡胚培养的优缺点：
优点：来源充⾜；物美价廉；适⽤于多种病毒；操作⽅便，⽆
须特殊设备；对接种的病毒不产⽣抗体。
缺点：可能含有某些家禽病毒的母源抗体；可能携带垂直传播
的病原体；以及需要第⼆指⽰系
统来鉴定病毒。
鸡胚接种的⽅法：
不同的病毒，鸡胚接种的部
位不同；最常⽤的鸡胚接种部位
有：尿囊腔接种、⽺膜腔接种、
绒尿膜接种、卵黄囊接种等等。
③、细胞培养
病毒严格细胞内寄⽣，培养
病毒必须使⽤细胞。实验动物、
鸡胚都拥有⼤量活的细胞，可⽤
于病毒培养。尤其是SPF动物或
SPF鸡胚，⽬前仍然经常供病毒培
养之⽤，但是发展最快、应⽤最多的还是细胞培养。
细胞培养（Cell culture）是指利⽤机械、酶或化学⽅法使动物组织分散成单个细胞悬液，适当洗涤后，加⼊营养液，或使⽤传代细胞进⾏培养。已成为病毒分离、培养、鉴定的重要⽅法。所⽤培养液是含⾎清（通常为胎⽜⾎清）、葡萄糖、氨基酸、维⽣素的平衡溶液，
pH7.2～7.4。细胞培养适于绝⼤多数病毒⽣长，是病毒实
验室的常规技术。
细胞培养中的每个细胞的⽣理特性基本⼀致，对病毒
的易感性也相等，没有实验动物的个体差异，不涉及动物
保护问题。⽽且可⽤于试验的数量远远超过动物或鸡胚，
并且可在⽆菌条件下进⾏标准化的试验，可重复性好。
A细胞培养的类型
A1、原代细胞
应⽤胰酶等分散剂将动物新鲜组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤后，加⼊培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞。这样长出的细胞培养物称作原代细胞。原代细胞均为⼆倍体细胞，可⽤于产⽣病毒疫苗，如兔肾细胞⽣产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产⽣⿇疹疫苗，猴肾细胞⽣产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便⽤于诊断⼯作。
A2、⼆倍体细胞株
将已长成单层的原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来后
再作培养，就是继代细胞。原代细胞只能传2～3代细胞
就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且
保持正常体细胞⼆倍体组型的染⾊体等，染⾊体的数⽬和
形态正常。这种⽆污染的原代细胞和继代细胞称为⼆倍体
细胞株（为⼆倍体细胞或细胞株）。这种细胞因具有“接
触抑制性”，故⼀般只能形成单层细胞。⼀般可在体外传
⼏代、⼏⼗代⾄⼀百代左右，此后不可避免地逐渐衰⽼死
亡。
⼆倍体细胞⽣长迅速，并可传50代保持⼆倍体特征，
通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。⼆倍
体细胞⼀经建⽴，应尽早将细胞悬浮于10%⼆甲基亚砜中，
⼤量分装后贮存于液氮（-196℃）内，做为“种⼦”，供
以后传代⽤。⽬前多⽤⼆倍体细胞系制备病毒疫苗，也⽤
于病毒的实验室诊断⼯作。
庄启传
力量组合A3、传代细胞系
由于遗传突变或者在理化学致癌物质和致瘤病毒的作⽤下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞即癌变细胞。这种细胞具有很⾼的⽣长和增殖势能，⽽且⼏乎可以⽆限地传代，故称为传代细胞系。换⽽⾔之，
传代细胞系通常是由癌细胞或⼆倍体细胞突变⽽来（如 Hela、Vero细胞系等），染⾊体数为⾮整倍体，细胞⽣长迅速，可⽆限传代，在液氮中能长期保存；也称为细胞系。
⽬前⼴泛⽤于病毒的实验室诊断⼯作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使⽤。由于担⼼治肿瘤的潜在危险，传代细胞⼀般不能⽤于制备疫苗。传代细胞系均有通⽤的名称，如Hela（⼈⼦宫癌细胞）、Vero（⾮洲绿猴肾细胞）、
BHK21（乳仓⿏肾细胞）、PK15（猪肾细胞）等，并有专门机构负责鉴定和保管，如ATCC (American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中⼼、CCTCC 中国典型培养物保藏中⼼（武汉⼤学）等。
B细胞培养的类型
最常⽤的⽅法为静置培养及旋转培养。为满⾜某些特定的需要，还可以有悬浮培养或微载体培养技术等。
B1、静置培养
广州黄埔造船厂将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶（管）或培养板（孔），封闭，静置于恒温箱内，数天后细胞可以⽣成贴壁的单层细胞。如⽤细胞培养板，⼀般需要培养在含有5% CO
条件下。
2
福泽谕吉
哺乳动物及禽类的细胞培养温度⼀般为37℃，鱼类等变温动物则视其⽣存环境的温度⽽定，温⽔鱼细胞⼀般25～28℃，冷⽔鱼细胞15～20℃。昆⾍细胞培养有特殊的培养条件。
B2、旋转培养
基本⽅法与静置培养相同，不同之处是要培养的细胞不是静⽌，⽽是使之不断缓慢旋转（5-10r/h）经过⼀段时间，细胞可在培养瓶（管）的四壁长满单层。此法的产量⾼，适⽤于疫苗⽣成。某些病毒如轮状病毒、冠状病毒，⽤旋转培养⽐静置培养分离野毒更容易获得成功。
B3、悬浮培养
通过搅拌使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正
pH，使之⽣长或维持存活。此法适⽤于某些不需要贴壁
⽣长的细胞系。
B4、微载体培养
在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。微载体是直径35～100µm的微⼩颗粒，对细胞⽆毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量多，单位体积的表⾯积较⼤，所获得的细胞数也⽐上述常规⽅法⼤为增加，对规模化的细胞或疫苗⽣产很有吸引⼒，虽然增⾼了成本。微载体有若⼲型号，已经商品化。
C细胞培养的优缺点
优点：克服体液因素的影响；克服个体差异的
影响等。
缺点：需要⼀定的细胞培养技术；需要特殊
的细胞培养设备等。
3、分离病毒的鉴定
（1）病毒在细胞内增殖的指征
①细胞病变效应(Cytopathogenic effect，CPE)
黑街圣徒2病毒在细胞内增殖可引起细胞病变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产⽣特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。
免疫荧光（IF）法⽤于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着⾊，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿⾊荧光，根据所⽤抗体的特异性判断为何种病毒感染。
②红细胞吸附现象（Hemadsorption phenomenon）
流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24～48⼩时，以细胞膜上出现病毒的⾎凝素，能吸附豚⿏、鸡等动物及⼈的红细胞，发⽣红细胞吸附现象。若加⼊相应的抗⾎清，可中和病毒⾎凝素、抑制红细胞吸附现象的发⽣，称为红细胞吸附抑制试验。这⼀现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。
③⼲扰现象 (Interference phenomenon)
⼀种病毒感染细胞后可以⼲扰另⼀种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫⼲扰现象。前者为不产⽣CPE的病毒（如风疹病毒）但能⼲扰以后进⼊的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进⼊宿主细胞不再⽣产CPE。
④细胞代谢的改变
病毒感染细胞可使培养液的pH值发⽣改变，说明细胞感
染后代谢发⽣了变化。这种培养环境的⽣化改变也可作为判
定病毒增殖的指标。
（2）病毒感染单位的测定
测定样本中病毒的浓度，即病毒的滴度（titer）是病毒学中最重要的技术之⼀。病毒滴度可以通过⽤系列稀释的病毒接种细胞、鸡胚或实验动物。常⽤于病毒滴度测定的技术有空斑实验、终点稀释法、荧光-斑点试验、转化试验等，最常⽤的是前两种。
①空斑试验：Dulbecco（杜尔贝科，美国科学家）
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