遗传变异
⼝蹄疫病毒⾼度变异，有7个⾎清型，⾎清型之间互不交叉保护，有多个亚型和变异毒株，以及不计其数的新分离毒株。抗原多样性使得⼝蹄疫免疫预防越来越困难，世界各地采⽤有限的疫苗毒株防疫⼤量的⽥间流⾏病毒。免疫效果不佳是预防易变RNA病毒病的最⼤挑战。⼝蹄疫病毒作为RNA病毒，没有独⽴⾃主的繁衍增殖体系，必需依赖宿主，利⽤宿主细胞部分功能复制繁衍，病毒⾃⾝核酸物质不断产⽣新的⼦代病毒，但⾃⾝复制所依赖的RNA聚合酶没有⾃我修复维持遗传稳定的功能，所以病毒快速⼤量繁殖，在⽣存环境中优胜劣汰，从⽽决定了病毒的遗传变异多样性。 ⼀、准种的概念
准种（quasispecies）是由Eigen等于20世纪70年代初提出，⽤以解释能够⾃我复制的简单RNA或类RNA分⼦的⾃我组装和适应能⼒的⼀种数学模型。从物理学⾓度看，准种是序列空间中的“云”，即病毒基因组全部核苷酸，在序列空间⾼度联通促使病毒突变获得适应⼒。从化学⾓度看，准种是相关但不相同的基因组的额定分布。在⽣物学上，准种是体⽔平上⽽不是单个基因⽔平的选择，强调突变的产⽣和同⼀种突变的相互作⽤。病毒学家研究认为，病毒准种是经过连续遗传变异、竞争和选择所产⽣的密切相关的突变和重组病毒基因组的动态分布，这⼀理论为认识RNA病毒的适应性和致病机制，制定防
控病毒性疾病新策略奠定理论基础。
⼆、⼝蹄疫病毒遗传变异的分⼦基础与研究⽅法
⼝蹄疫病毒具有显著的准种特性，病毒基因组RNA没有单⼀明确的核苷酸序列，⽽是以的形式存在。基因组为单股RNA，以RNA为模板，利⽤依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）合成RNA，但该酶缺乏校对功能和复制后的修复功能。RNA复制转录期间，每个核苷酸平均突变率为10-5～10-3，还可以发⽣同源性或⾮同源重组，以及基因⽚段混合，从⽽造成病毒基因组的多样性和适应性。近来采⽤核苷酸突变异构体筛选出⾼保真RdRp突变体，经反向遗传学技术和毒⼒测定证明了⾼保真RdRp突变体与毒⼒的关系，为⼝蹄疫病毒准种和新型弱毒疫苗研究提供了重要数据。尽管所有微RNA病毒的突变率均在10-5～10-3范围，但对病毒抗原变异，及其导致疫苗免疫效⼒的影响程度不同。例如，Mengo病毒有1个⾎清型，脊髓灰质炎病毒有3个⾎清型，⼝蹄疫有7个⾎清型，⼈⿐病毒则有100多个⾎清型。表明即使病毒基因组组成和病毒粒⼦结构相似，其抗原多样性变异程度也不同，但造成这些差异的分⼦基础尚不清楚，需要⽣物化学家和进化⽣物学家沟通与共同研究。
ip交换机随着科学技术的发展，分⼦克隆技术、⾼通量序列测定技术等现代分⼦⽣物学技术成功地应⽤于⼝蹄疫病毒遗传变异研究。⾸先，采⽤统计学技术进⾏病毒感染动物分离株优势序列的系统发⽣分析，创建了全新的基因型分类，逐渐取代了⾎清学⽅法的传统分类法，系统发⽣树研究有助于暴发疫情的疫
源追踪和⼝蹄疫流⾏病学研究。根据核苷酸序列绘制系统发⽣树的常⽤算法有最⼤似然法（maximum likelihood）、基于距离的最⼩进化法（minimum evolution）和基于性状的最⼤简约法（maximum parsimony）等，⽆论何种⽅法都要进⾏统计置信度检验，如⾃举检验法(bootstrap test)、⼑切检验法（Jackknife test）、似然⽐检验（likelihood ratio test）和贝叶斯法（Bayesian）等，常采⽤的⽣物信息学软件有CLUSTALW 系列、BioEdit、MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）系列、BEAST、SPREAD、PHYLIP、PAUP（phylogenetic analysis using parsimony）、PAL(phylogenetic analysis library)、Bionumetrics、TurboTree、GeneTree、ODEN、fastDNAml、MOLPHY、PAML等。其次，采⽤⽣物或分⼦克隆技术和快速核苷酸序列测定技术可以实现在准种⽔平研究病毒基因组的结构与组成。病毒在感染宿主或细胞复制过程中组成遗传种，研究该种的⼤⼩和遗传异质性对于认识病毒致病机制具有重要意义。⼝蹄疫病毒细胞培养时可以形成单⼀蚀斑（理论上是由单个病毒颗粒感染引起），通过分⼦克隆测序技术分析单个感染基因的⼦代，该⼦代是由⼤量复制突变体构成的种或基因组池，适应环境变化，某⼀种可能成为优势种。采⽤新型快速⾼通量测序技术，进⼀步掌握病毒在细胞、感染机体中快速增殖、选择、适应构成的准种。⼝蹄疫病毒发⽣遗传变异最终的主要表现形式是：（1）致病性发⽣变化，导致对动物的毒⼒增强或减弱，或对某种特定动物的毒⼒发⽣变化，造成新的⼤流⾏；（2）抗原性发⽣变化，导致免疫预防失败。
三、⼝蹄疫病毒抗原变异
抗原匹配性是⼝蹄疫病毒遗传变异研究的重要内容，及时掌握病毒抗原变异与疫苗抗原匹配性是⼝蹄疫免疫防控措施成败的关键。⽬前采⽤VP1核苷酸序列差异进⾏⼝蹄疫病毒分离株遗传关系分析和疫源追踪，在分⼦流⾏病学中发挥了重要作⽤，⼈们试图采⽤测定核苷酸序列推导氨基酸序列，⽐较分析并推测抗原性，但研究结果表明仅采⽤全部结构蛋⽩质氨基酸序列分析流⾏毒株与疫苗的匹配性是不可靠的。由于补体结合试验r值测定进⾏亚型鉴定逐渐被基因型分类所取代，新分离毒株抗原性的分析应有适合的⽅法。应⽤⽐较⼴泛⽽且被⼈们所接受的⽅法主要是r值测定法，r值可以采⽤中和试验或液相阻断ELISA进⾏测定，r=（免疫⾎清+被检病毒）/（免疫⾎清+疫苗毒株），免疫⾎清为疫苗免疫⽜21d分离的⾎清或免疫猪28d分离的⾎清。r值是单向关系值，反映了⼀个毒株的抗⾎清对另⼀个毒株抗原的交叉反应程度。在中和试验中，r值⼤于0.3表明疫苗毒株与⽥间流⾏毒株抗原相似，其疫苗可以保护⽥间流⾏毒株的攻击，r值⼩于0.3表明它们之间抗原差异明显，疫苗不能保护流⾏毒株的攻击，建议选择流⾏毒株更换疫苗种毒。如使⽤ELISA测定法，r值为0.4～1，⽥间分离毒株与疫苗毒株抗原关系密切，r值为0.2～0.39，⽥间分离毒株与疫苗毒株抗原有相关性，
法，r值为0.4～1，⽥间分离毒株与疫苗毒株抗原关系密切，r值为0.2～0.39，⽥间分离毒株与疫苗毒株抗原有相关性，但其疫苗为了获得较好保护率，应加强免疫，r值⼩于0.2表明毒株差异明显，其疫苗⽆保护⼒，建议选择流⾏毒株更换疫苗种毒。
将分析抗原变异的r值测定与⽤于流⾏病学疫源追踪的序列分析法结合分析流⾏毒株与疫苗毒株关系的
⽅法，称之为抗原图谱法（antigenic cartography），⽤以改进疫苗毒株匹配试验，提⾼疫苗免疫效果。⽐较病毒⾐壳蛋⽩P1编码序列推测抗原差异，结果发现中东使⽤最普遍的A型⼝蹄疫病毒疫苗毒株A22/IRQ/24/64，与抗原性不匹配的流⾏毒株存在⼀个关键氨基酸VP1第149位突变的差异。研究发现仅采⽤遗传序列数据或结合毒株分布流⾏数据来预测抗原性还不够确切，在同⼀个地区遗传数据极为相似的2个流⾏毒株之间，其抗原性仍有显著差异。将5株Ａ型⼝蹄疫病毒分别制备疫苗免疫，每个疫苗免疫5头⽜，制备免疫⾎清，再采⽤不同⽅法测定ｒ值，结果采⽤ROC进⾏统计分析，发现采⽤ELISA 测定的r值具有统计学意义，可靠性较⾼。
四、⼝蹄疫病毒致病性变异
⼝蹄疫病毒可以感染70多种偶蹄动物，但感染每种动物临床症状的严重程度不同，家畜中⽜和猪临床症状严重，⽽⽺临床症状轻微，1997年发现仅感染猪的⼝蹄疫病毒，即所谓嗜猪毒株，⼝蹄疫病毒在细胞或其他⾮易感动物上连续传代后会降低对本动物的致病性，这些现象表明⼝蹄疫病毒的致病性会发⽣变异。⼝蹄疫病毒的致病性是指病毒感染动物后引起病症的能⼒，取决于病毒的感染⼒和毒⼒，病毒侵⼊宿主动物越多，并能在宿主体内⼤量增殖造成严重的临床症状，表明毒株致病性越强。
继承法的基本原则
细胞培养中的变异：细胞培养的⼝蹄疫病毒是研究微RNA病毒准种特性的最佳实验材料，Domingo等
利⽤细胞培养的病毒在⼝蹄疫病毒遗传变异⽅⾯做了⼤量⼯作，为RNA病毒准种概念提供了⼤量的试验数据。准种是在⾼突变率、RNA 复制特性及选择压⼒下竞争性适应中不断进⾏复杂的平衡。这⼀属性反映了RNA病毒的⾼度变异性和⾼度适应性。克隆纯化病毒在急性或持续感染细胞培养中进⾏有限代次的增殖，即可观察到⾼突变率⼝蹄疫病毒种的遗传异质性和抗原异质性。克隆病毒进⾏扩增分离到⼤量单克隆抗体突变株病毒，显⽰了⼝蹄疫病毒种的抗原异质性。疫苗⽣产和检验⼀般要求对毒株进⾏连续传代，虽然疫苗是有效的，在没有免疫压⼒下繁殖病毒也会出现抗原变异毒株。⼝蹄疫病毒持续感染BHK-21细胞连续传代病毒，有核苷酸替换和异质现象的逐渐积累，最后导致表型发⽣变化。持续感染中病毒和细胞可协同进化，感染初期，病毒对细胞的毒⼒强，细胞对病毒的抵抗⼒也强，随着感染的延续逐渐达到平衡。在稳定的细胞培养环境中适应并增殖了数代的病毒，分析病毒种发现，连续传代的病毒种的⼤⼩影响病毒的适应性和变异。O型⼝蹄疫病毒经细胞连续传代，VP3第56位氨基酸发⽣突变，由组氨酸变为精氨酸，感染细胞利⽤的受体由整合素变为硫酰肝素，由于⼄酰肝素是⽐较普遍存在的细胞表⾯分⼦，所以连续传代的病毒获得了感染更多细胞的能⼒。研究发现中国的⼀株制苗毒株，经细胞传代后该毒株对乳⿏的致病⼒下降，LD50由8.0降低到6.0左右，但对BHK-21的感染能⼒增强，TCID50由7.5提⾼到9.0，⽐较该毒株变异前后发现由于VP1上4个氨基酸的突变造成病毒所识别的受体发⽣了改变，造成病毒对乳⿏和BHK-21细胞致病性发⽣变化，同样这种变异也造成该病毒宿主范围扩⼤，可以在多种正常情况下⼝蹄疫病毒不能感染的哺乳类动物细胞上⽣长。⼝蹄疫病毒细胞培养研究模型中发现病毒准种有进化记忆的功能，并以⼀种突变谱的形式储存记忆，将对持续感染机理研究有重要意义。
宿主动物中的变异：每⼀种病毒均有其易感宿主，⼝蹄疫病毒的易感动物为⽜、⽺、猪等偶蹄动物，将病毒接种其他⾮易感动物，将造成病毒变异，并以此特性研制弱毒疫苗，20世纪50—60年代采⽤⼩⿏、兔、鸡胚、鸭胚等致弱⼝蹄疫病毒，造成病毒变异，病毒对不同种类易感动物感染性发⽣改变，或病毒基因组发⽣改变。⽤克隆纯化的病毒感染动物，从单个动物个体分离病毒，发现分离病毒的序列有差异，即具有遗传不均⼀性。蚀斑纯化病毒感染猪分离病毒有明显的遗传物质和表型的不均⼀性，从持续感染⽜上分离的病毒分析同样也有病毒种的不均⼀性，突变率⾼达
0.9×10-2到7.4×10-2s/s/yr。⽥间暴发疫情中也存在⼤量VP1等结构蛋⽩基因的突变，以及抗原性和免疫性选择突变毒株。⽜合成肽疫苗研究中发现，合成肽免疫后⽤强毒攻击的29头发病⽜中，12头发病⽜的分离病毒含有针对合成肽抗原位点A的氨基酸突变病毒，表明病毒可在动物体内快速发⽣选择性抗原变异。⼩⼉⿇痹是由微RNA病毒科的脊髓灰质炎病毒引起的，已成功地利⽤弱毒疫苗控制和消灭了该病。属于同⼀科的⼝蹄疫病毒能否研究出弱毒疫苗，在世界各地相继开展了弱毒疫苗的研制，南美培育成功了O型和C型鸡胚致弱毒株，该毒株对⽜致病⼒显著减弱。中国培育出O型乳⿏传代毒株。但⼝蹄疫不同于脊髓灰质炎病毒，很难将⼀种动物致弱毒株适应于其他动物。1997年发⽣以感染猪为主的O型⼝蹄疫，该毒株20世纪70年代出现在中国⾹港，90年代出现在菲律宾。以感染猪、不感染⽜为主要特征，核苷酸序列分析发现该毒株⾮结构蛋⽩3A编码区缺少30个核苷酸。有学者将缺失10个氨基酸的3A替换到O1Compose强毒株，结果发现3A显著改变了O1Compose强毒株对⽜的致
病性。同样对南美O型和C型鸡胚致弱毒株序列测定发现，该毒株3A分别缺失19个和20个氨基酸，3A的缺失和⽜的致病⼒有关，但对猪却有很强的致病⼒，结果表明⼝蹄疫病毒在动物体内发⽣遗传物质和适应性变异。黄镇将军
五、⼝蹄疫病毒流⾏毒株变异ELECTRONICSWORKBENCH
安晋辰⽥间分离毒株核苷酸序列分析表明⼝蹄疫病毒基因组包括ORF和⾮编码区均可以发⽣突变，但有选择压⼒的基因组更容易发⽣突变积累，特别是结构蛋⽩VP1，该蛋⽩为主要抗原蛋⽩，在G-H环上和羧基端含有重要的抗原位点和受体识别位点，所以VP1蛋⽩编码基因是⼝蹄疫病毒遗传变异研究和分⼦流⾏病学研究的⽬标基因。⼝蹄疫病毒G-H环上主要抗原位点变异的机理是氨基酸替换的逐渐积累和个别关键氨基酸的突然改变，类似于流感病毒的抗原漂移（draft）和抗原迁移（shift）。⼤量⽥间分离毒株和单克隆抗体突变毒株的分析研究发现，病毒结构蛋⽩表⾯分布着不同抗原位点，有
迁移（shift）。⼤量⽥间分离毒株和单克隆抗体突变毒株的分析研究发现，病毒结构蛋⽩表⾯分布着不同抗原位点，有线性表位，也有构象性表位，凸显于病毒粒⼦表⾯，均有关键氨基酸，暴露于病毒粒⼦的抗原位点会优先发⽣替换，但事实上变化是有限的。此外，对C型病毒60年的演化历程分析，尽管有同义核苷酸替换积累，但很少造成氨基酸的替换，说明维持结构的稳定，反⽽约束了表⾯氨基酸的变化。除结构蛋⽩编码基因的改变外，其他部分包括⾮结构蛋⽩编码基因，甚⾄⾮编码区基因也
会发⽣改变，例如，5′UTR Poly（C）的长短可能与病毒毒⼒有关，3A的缺失可能与对⽜的致病⼒强弱有关。
虽然分析核苷酸序列，特别是结构蛋⽩编码序列，并不能反映出⽥间分离病毒的抗原性和相互的抗原关系，但分析⽥间分离病毒的全基因组序列或最易变的VP1蛋⽩编码序列已⼴泛应⽤于⼝蹄疫病毒遗传变异分析、疫源追踪和疫情预测预报，正在为⼝蹄疫防控发挥着重要的作⽤。
（⼀）A型⼝蹄疫病毒的变异
A型⼝蹄疫病毒是7个⾎清型中抗原性变异最⼤的⾎清型，不同毒株之间交叉保护⼒差。A型⼝蹄疫病毒在⾮洲、亚洲、欧洲和美洲均有流⾏，可分为3个拓扑型，26个基因型，除个别基因型在不同的⼤陆有流⾏外，⼤部分基因型病毒有⼀定的地域分布规律。毒株的分布可能与⼈、动物及产品流动，疫苗的使⽤以及免疫造成的免疫压⼒等有关。A型⼝蹄疫病毒亚洲拓扑型毒株最活跃，变异最⼤，采⽤单⼀疫苗毒株制备疫苗，免疫动物不能完全保护所有同型流⾏毒株，已鉴定出A型⼝蹄疫病毒结构蛋⽩VP1～3上有36个与抗原性有关的关键氨基酸（VP2：72，79，80，132，133，196；VP3：58，59，61，70，136，139，175，178，195；VP1：83，137，139，141，143，145，147～
154，159，170，173，199，201，205和 209)。
⽬前，中东地区主要流⾏基因型26，A/Iran-05谱系毒株，该地区使⽤最⼴的疫苗毒株为A22/IRQ/24/64，以及匹配性更强的A/Iran-96和A/Iran-99毒株，A/Iran-05毒株2003年⾸先在伊朗出现，疫苗毒株随即更换为A/Iran-05谱系毒株，后来⼜更替为A/TUR/2006，但近年来分离毒株与A/TUR/2006的匹配性⼜发⽣改变，由此可见A型⼝蹄疫病毒抗原变异之活跃。对1996—2011年中东地区分离毒株与疫苗毒株A22/IRQ/24/64和A/TUR/2006进⾏r值测定分析，同时进⾏结构蛋⽩P1区序列⽐较分析，抗原位点1、2和4的氨基酸变异参与抗原变异，A/Iran-05谱系毒株P1区序列核苷酸取代率为
车载卫星电视1.06×10−2/s/yr，在中东地区每5～10年病毒抗原性就会发⽣更替，出现新变异毒株。
印度在1986年前流⾏基因型2，1990年前流⾏基因型4，1990—2001年基因型16和18共同流⾏，⾃2001年主要流⾏基因型18。基因型16和18，不仅核苷酸序列有差异，抗原性也有差异，2009年采⽤基因型18的IND40/2000为疫苗毒株，代替了传统疫苗毒株基因型16的IND17/1982。⽬前流⾏的基因型18毒株VP3-59缺失毒株分别造成2002—2003年和2007—2008年⼤流⾏，可能由于免疫压⼒下，蛋⽩VP3关键氨基酸发⽣选择性跳跃突变。传统的r值测定分
析，IND40/2000可以保护⼤多数⽥间流⾏的基因型18毒株，但对新出现的部分VP3-59缺失毒株r值⽐较⼩。对基因型18 VP3-59缺失和VP3-59不缺失的⽥间分离毒株、疫苗毒株IND40/2000和IND17/198
2进⾏核苷酸序列分析⽐较及与代表毒株r值测定分析，基因型18存在明显的两个组（VP3第59位氨基酸缺失组和不缺失组），进⼀步⼜可以分为不同亚谱系18a、18b和18c，表明A型病毒仍然处于不断进化之中，虽然IND40/2000疫苗毒株可以覆盖2002—2009年的⼤部分离株，并使⽤IND281/2003毒株和IND195/2007株作为VP3-59缺失组和未缺失组的代表毒株补充IND40/2000疫苗毒株的不⾜，但也⽆法确保能覆盖未来不断变化和出现的流⾏毒株。
东南亚主要流⾏亚洲拓扑型Sea-97谱系毒株，东南亚地区使⽤的疫苗种毒株为A/MAY 97和A22/Iraq，泰国A型⼝蹄疫抗原变异分析，1997年后期推荐使⽤A/Sakol/97疫苗毒株，2001年开始使⽤A/Thailand 118/87毒株，近年来（2010—2012年）分析发现A型病毒抗原性发⽣变异，2010年底⼜推荐使⽤A/Sakol/97疫苗毒株。其中A/Sakol/97等同于国际疫苗中的A/MAY/97。20世纪50—60年代中国北⽅与苏联交界边境地区发⽣过A型⼝蹄疫，这些毒株⼤多属于A22系列毒株。此后⽆⼤规模A型⼝蹄疫的发⽣，但在2009年和2013年在武汉等地发⽣A型⼝蹄疫疫情，分析毒株为亚洲拓扑型Sea-97谱系毒株。
⼝蹄疫病毒A型⾮洲拓扑型，有8个基因型，例如，肯尼亚1952年⾸次报道A型⼝蹄疫，曾经使⽤2个疫苗毒株（K18/66和K179/71）进⾏A型⼝蹄疫免疫预防，⽬前则使⽤另外2株疫苗毒株（K5/1980和K35/1980）。对该国1964—2013年分离的A型病毒遗传变异分析研究，A型⾮洲拓扑型的4个基因型（G-I、G-III、G-VII和G-VIII），以及由G-I衍化⽽来的第5个谱系的病毒在肯尼亚流⾏。G-III和G-VIII
⾸次出现在1964年，但现已经消失，G-VII已于2005年消失，⽽G-I（包括新谱系）⽬前在肯尼亚⼴泛流⾏。2003—2013年，G-I基因型的G-Id病毒和含有疫苗毒株K5/1980G-Ib簇之间核苷酸变异率为14%，估计核苷酸取代率为4.22×10-3s/s/yr，⽐中东地区流⾏⼴泛的亚洲拓扑型A-Lran05谱系毒株VP1的突变率（1.25×10-2s/s/yr）低，但⽐当地流⾏的其他⾎清型SAT2型2.42×10-3s/s/yr，O型2.7×10-3 s/s/yr⾼，表明肯尼亚A型病毒遗传变异速度快，所以防疫中采⽤多株疫苗毒株。
（赵启祖，邹兴启，朱元源）
*此章节内容摘录来源于动物疫病防控出版⼯程丛书《⼝蹄疫》，读者朋友若购买此书及了解其他相关信息欢迎登陆中国农业出版社⽹站ap
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