刘晓东;杨旭兵;王福军;刘红祥;李坤;胡继明;梁俊超;王全溪;高丰
【摘 要】Since May 2006,a high fever syndrome disease had been outbreaking in many pig farms in China,which mainly causes sow abortion,stillbirth,mummification and other reproductive disorders,as well as a variety of respiratory diseases among various age of pigs.To confirm the molecular genetic variation of PRRSV in domestic situation,36 PRRSV wild virus and 8 vaccine virus were investigated.The results showed that all PRRSV wild virus in 2014 belonged to subgroup 4 of the North American strain.The results of homology comparison showed that these isolation virus shared 62.8%~65.5% similarities with European strain LV,85.9%~89.4% similarities with North American prototype VR2332,91.7%~94.4% similarities with the classical strain CH1A and CH1R,and 95.5%~99.2% similarity with highly pathogenic PRRSV strains TJM-F92,JXA1,HUN4.The results of amino acid homology comparison showed that there were some variations in neutralization epitopes,virulence sites and N-glycosylation sites in the isolates from 2014 co2013辽宁高考理综
mpared with the first subtype virus.Therefore,it is concluded that PRRSV wild isolations are in the constant mutation.%自2006年5月开始在我国爆发一种猪高热综合症,主要引起母猪流产、死胎、木乃胎伊等繁殖障碍,以及各种日龄猪的呼吸道疫病.为了进一步了解我国PRRSV的分子遗传进化情况,对2014年36株PRRSV分离毒株以及8株疫苗毒株的GP5进行分析比较.结果表明,2014年所选PRRSV的分离毒株均属于北美洲型第四亚.同源性对比显示,与欧洲毒株LV的同源性为62.8%~65.5%,与VR2332的同源性85.9%~89.4%,与经典毒株CH1A的同源性91.7%~94.4%,与高致病性蓝耳病TJM-F92、JXA1及HUN4毒株的同源性为95.5%~99.2%.氨基酸分析结果表明,与第一亚毒株对比,2014年分离株在中和表达位点、毒力位点以及N-糖基化位点均存在一定变异.可见,PRRSV野毒在不断的发生变异. 【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2017(038)007
【总页数】5页(P66-70)
【关键词】PRRSV;基因分析;gp5
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【作 者】刘晓东;杨旭兵;王福军;刘红祥;李坤;胡继明;梁俊超;王全溪;高丰
【作者单位】吉林大学 动物医学学院, 吉林 长春 130012;青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东 青岛 266000;福建农林大学 动物科学学院,福建 福州 350002;吉林大学 动物医学学院, 吉林 长春 130012
【正文语种】中 文
【中图分类】S811.5
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是20 世纪 80 年代末发现的一种接触性传染病，能引起妊娠母猪的死胎、流产、木乃伊胎等繁殖障碍，以及各种年龄猪的呼吸道疾病，称蓝耳病[1]。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似 PRRS 病例中分离到PRRSV[2]，从而证实了本病在我国的存在。但随着毒株的毒力变异，1997 年美国又出现了 PRRS 新的流行形式，即急性和非典型性蓝耳病(acute and a
typical PRRS)，引起母猪发生更高的流产率和死亡率[3-5]。2006年我国大面积暴发变异毒株猪蓝耳病，给我国养猪业带来大规模的经济损失。
天冬酰胺研究表明 PRRSV 的主要中和位点位于GP5 蛋白[6-7]。此外，GP5对 T 淋巴细胞增殖反应的刺激作用仅次于M蛋白，表明 GP5在诱导 PRRSV特异性细胞免疫中也具有重要作用。至今已有多位学者利用GP5序列的差异性来进行PRRSV 的遗传进化研究[8-9]。对2014年于我国8省分离的36株野毒与疫苗代表毒株进行比对，分析其遗传进化及分子流行病学，为以后PRRS的流行趋势及防疫提供理论基础。
1.1 病毒样品
2014年在全国 (山东、福建 、浙江、江苏等)采集的疑似PRRSV感染的临床样品按照文献[10]介绍的RT-PCR方法进行检测。利用病毒RNA提取试剂盒(TAKARA 公司) 提取总RNA及RT试剂盒(罗氏公司)进行反转录反应。利用ORF5引物(上游:CATTTCATACACCTGAGACCAT,下游:AGATCATATATCATCACTGGCT)进行PCR扩增。扩增条件为94 ℃～变性2 min 后进入循环: 94 ℃～15s,54 ℃～30 s,68 ℃～1 min,32个循环后,68 ℃～10 min。PCR 产物经回收纯化后送至TaKaRa公司测序。
1.2 主要试剂
RNA提取试剂盒购于TAKARA公司；高保真反转录试剂盒购于罗氏公司；LATaq DNA聚合酶购于宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 PRRSV GP5测序
将RT-PCR产物送至大连宝生物公司进行测序。
1.4 分子进化分析
利用序列分析软件DNA star Lasergene 对所选毒株ORF5基因进行序列比对，分析其同源性，利用MEGA6软件制作进化树。
2.1 RT-PCR检测结果
对所检测样品GP5进行RT-PCR检测到773bp的目的条带表明所检样品均为PRRSV(图1)。
2.2 分离毒株与代表毒株进化树：
胡银波
对102株毒株GP5基因序列分析(图2)，结果发现，本次分离的36株野毒均属于第四亚。
2.3 分离毒株ORF5基因序列与进化分析
基于102株毒株GP5基因序列分析，可将PRRSV GP5分为北美洲型与欧洲型2个，其中北美洲型可分为4个亚，其代表毒株为第一亚：VR2332 MLV;第2亚：CH1R,CH1A;第三亚:HB1，HB2;第四亚：TJ2006,JXA12006,HUN42008,2006年之前分离毒株主要为前三亚，2006之后分离毒株主要集中于第四亚，其中2014年在我国8省所分离的36株野毒均属于第四亚(如图2)。
2.4 分离毒株与标准毒之间核苷酸同源性分析
将所分离毒株与标准毒株核苷酸通过DNASTAR进行同源性对比发现(图3)，2014年所分离的36株野毒GP5与欧洲型代表毒株的同源性为62.8%～65.5%；2006～2013年分离野毒株与欧洲型代表毒株的同源性为63.5%～64.5%；2014年毒株与第一亚代表毒株VR2332GP5的同源性为85.9%～89.4%；2006～2013年所选蓝耳毒株与第一亚同源性为88.2%～89.6%；2014分离毒株与第二亚CH1R,CH1A GP5的同源性为91.7%～94.4%；
2006～2013年所选蓝耳毒株与第二亚同源性为92.7%～94.7%；2014年所分离毒株与第四亚代表TJ2006、JXA1以及HUN4GP5的同源性为95.5%～99.2%，2006～2013年所选蓝耳毒株与第四亚同源性98.3%～99.8%。
第28次中国互联网络发展状况统计报告2.5 分离毒株与标准毒之间氨基酸同源性分析
氨基酸对比发现2014分离毒株与欧洲毒株同源性为54.8%～58.9%；2006～2013年为56.9%～58.9%，与第一亚氨基酸同源性84.1%～89.1%(2006～2013年为86.6%～89.1%)；与第二亚氨基酸同源性88.1%～92.5%(2006～2013年为91.5%～93.5%)，与第四亚氨基酸同源性92.5%～99%(2006～2013年为97.5%～99.5%)。
2.6 氨基酸序列分析
2014年分离的36株PRRSV均为HP-PRRSV,与第一亚代表毒株VR2332进行比对 GP5 的氨基酸位点，突变了23个：E3 →G3;G9→C9;S16→F16;C24→Y24;F25→L25;A29→V29;D34→N34;S35→N35;L39→I39;N58→Q58;S66→T66;A92→G92;V94→A94;F101→Y101;V102→Y102;T121→I121;F127→L127;A137→S137;I161→V161;R164→G164;V185→A185;I189→L189,P200→L200。
HP-PRRSV氨基酸序列中位于第37-44位的SH(F/L)QLIYN为其中和表位，F/L39为中和抗
体的表达位点[11]。以VR2332毒株为代表第一亚为L39;以CH1R毒株为代表第二亚为F39;以HB-2毒株为代表第三亚为F39;以TJ2006,JXA1,HUN4毒株为代表第四亚为I39。2014年分离的36株PRRSV中有SDZZ-1402与FZ2135-1402两株为F39其余34株均为I39。
GP5相关的毒力位点为氨基酸第13 和151位[12-13]。第一亚代表毒株VR2332为：R13,R151,第二亚代表毒株CH1R为：R13,R151;第三亚HB-2为：R13→Q13,第四亚代表毒株TJ2006,JXA1,HUN4为：R13,R151;2014分离的36株HP-PRRSV中有17株R151→K151，R13没有变化。
对于三个N一糖基化位点(N33N44和N51)的变化，N44与N51没有变化，N33变化较大，在第一亚中为N33;第二亚为N34,第三亚N34,第四亚中的代表毒株均为N34N35，2014年分离的毒株中有10株为N34,6株N35,20株N34N35(如图4)。
由进化图谱可以看出自2006年从中国江西省爆发高致病性蓝耳病后[14]，我国蓝耳病的主要流行毒株以PRRSV变异毒株为主。2014年分离36株PRRSV与第四亚的代表毒株TJ2006、HUN4以及JXA1同源性更近。而经典毒株的代表型MLV、VR2332以及CH1R与
现在分离毒株相对较远，属于第一与第二亚，免疫效果可能存在一定的限制，理论上同源性更高的第四亚中的疫苗毒株效果更好，但在免疫时需考虑到疫苗毒株的安全性。科研仪器
GP5蛋白是能够诱导机体产生PRRSV中和抗体的蛋白，其中的氨基酸位点的改变将改变中和抗体的效果。通过2014年分离的36株PRRSV毒株以及其他年份所选毒株GP5分析发现，能够表达中和抗体的GP5全长基因变异位点高达23个，同属于第四亚的36株2014年分离株在第151位毒力位点有17株R151→K151，由此可以推测同属于HP-PRRSV的不同地方的分离毒株，毒力之间也存在一定的差异。36株分离的HP-PRRSV毒株第37～44位的SH(F/L)QLIYN的中和表达[11]中有2株表现为经典毒株的F39，而非代表第四亚的I39。三个N-糖基化位点(N33N44和N51)的变化中，2014年分离的毒株中有10株为N34,6株N35,20株N34N35，由此可推断GP5蛋白中N-糖链以及中和表位在不断变化并逐步变异，在同一地区的不同毒株间这些主要位点也不尽相同，说明GP5一些主要位点的变化与变异并无地域性差异，是否随时间改变有特定变化还无具体理论数据。李广兴等[15]研究发现，2006～2012年猪繁殖与呼吸综合征病毒东北毒株 HLJDX01株 和 LN1101株的R151 →K151，但是这个突变是否会引起毒力的改变，仍然有待进一步的证实。野毒株R151的突变主要是影响了PRRSV的中和抗体抑制病毒的效果，对于毒力的影响仍然未见详细的报
导[16]。
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