第21卷6期中国病毒学21（6）：571-574
收稿日期：2006-05-16, 修回日期：2006-07-06
* 江苏省教育厅资助项目(JH03-028); 全国优秀博士论文作者专项资金资助项目(200256)
作者简介：王桂军(1969-)，男，安徽阜南籍，博士生，安徽农业大学副教授，从事动物病原分子生物学研究。
** 通讯作者. Corresponding author. E-mail: aijian@yzu.edu
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组病毒，而且表达的外源蛋白能够进行糖基化等修饰，具有天然蛋白的生物学活性[6]。本研究中我们采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统表达了我国新城疫病毒标准强毒株F48E8株F基因，为进一步研究F基因的生物学功能和新城疫基因工程疫苗创造条件。 1材料和方法
转座用E.coli DH10Bac、杆状病毒转移载体pFastBac1、逆转录酶M-MLV、总RNA 提取试剂和Lipofec
tin脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；pGEM-T easy vector、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶为Promega公司产品；琼脂糖回收试剂盒为QIAGEN公司产品；FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma 公司产品；沉淀性TMB底物溶液购自天为时代公司；新城疫病毒F48E8株和Sf9昆虫细胞为本实验室保存；抗NDV小鼠血清由本实验室制备。
1.2 RT-PCR和F基因的克隆
参考GenBank已发表的NDV F基因序列设计一对引物，5’端分别引入Bam HI和Xba I酶切位点，P1: 5’-GACGGATCCGCCCATTCAAAGTGCAAGAT-3’，P2: 5’- GCCTCTAGAGCCTCTTGTCTGCATTCACA-3’。RNA的提取按Invitrogen公司的总RNA提取试剂液操作说明进行；在引物P1和M-MLV反转录酶作用下合成cDNA，然后立即进行PCR。PCR回收产物和pGEM-T载体按3:1比例连接，转化，小提质粒，酶切鉴定正确后，命名为pGEM-NDF，由上海联合基因公司进行测序。
1.3表达转移载体质粒的构建和重组病毒的获得
按照参考文献[7]进行。主要步骤：用Bam HI和Xba I双酶切pGEM-NDF质粒和pFastBac1载体，构建pFast-NDF质粒，然后将pFast-NDF重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，获得的单个白菌落经连续纯化4次。重组Bacmid DNA的提取、PCR鉴定和转染按照Bac-to-Bac使用手册（Invitrogen）进行。
1.4 昆虫细胞表达的F蛋白的特异性检测间接免疫
荧光检测 SDS-PAGE和Western-blot
以P3代重组杆状病毒于96孔板感染Sf9细胞，27℃培养观察细胞变化，至感染后6d固定细胞，按常规方法进行间接免疫荧光检测。SDS-PAGE和Western-blot按参考文献[8]进行。
1.5表达的F蛋白的免疫原性
用感染P3代重组杆状病毒和野生杆状病毒的Sf9细胞，待细胞出现病变后收集细胞，经腹腔免疫小鼠免疫，每次每只150万个细胞，间隔10d后再次免疫，3次免疫后采集小鼠血清，按参考文献[1]进行间接免疫荧光检测和病毒中和试验。
2结果
2.1F基因的扩增和克隆
以F48E8株病毒RNA为模板，经RT-PCR 扩增出一条约1.7kb特异的目的片段。以Bam HI和Xba I酶切鉴定重组质粒pGEM-NDF，结果获得了与预期大小一致的DNA片段, 表明F基因克隆成功(图１)。
图1重组质粒双酶切鉴定
Fig.1Identification of pGEM-NDF by restriction dige stionusing Bam HI and Xba I
1, λHandⅢ DNA Marker; 2, pGEM-NDF.
2.2 PCR方法证明F蛋白表达载体构建成功
用上述方法构建的pFast-NDF质粒经Bam HI和Xba I双酶切后电泳，结果获得约1.7kb的目的条带和约4.77 kb大小载体条带(图2)。用pFast-NDF质粒转化大肠杆菌DH10Bac，白菌落经连续四次传代后，提取reBacmid-NDF重组质粒(图3)，进行PCR 扩增，结果扩增出约1.7kb的特异性片段，证明F基因成功转座；用reBacmid-NDF重组质粒转染
Sf9
图2 pFast-NDF酶切鉴定
Fig.2Identification of pFast-NDF by restriction digestion 1, pFast-NDF digested with Bam HI and Xba
I; 2, 1kb Marker.
图3reBacmid-NDF重组质粒PCR鉴定
Fig.3Identification of reBacmid-NDF by PCR
1, reBacmid-NDF; 2, λ HandⅢ Marker.
王桂军, 等. 新城疫病毒F 蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用 573
激点文学细胞，结果获得了重组杆状病毒，命名为rBac-NDF 。 2.3 F 蛋白在sf9昆虫细胞中成功表达
对感染了rBac-NDF 的昆虫细胞进行免疫荧光检测，结果表明，感染了rBac-NDF 的Sf9细胞能与NDV 多抗血清发生反应，在感染的Sf9细胞膜上产生特异的亮绿荧光，而野生型昆虫杆状病毒感染的Sf9细胞呈阴性反应，说明F 蛋白在昆虫细胞内得到表达（图4）。
图4 重组杆状病毒表达F 蛋白的间接免疫荧光检测
Fig. 4 Indirect immunofluorescence assay for F protein expressed in insect cells
A: 96 hours post-infection with rBac-NDF; B: 120 hours post-infection with rBac-NDF ; C: Sf9 cells infected with wild baculovirus.
2.4 表达的F 蛋白具有融合细胞作用
在rBac-NDF 病毒感染Sf9细胞后48h ，细胞即开始变圆；96h ，细胞逐渐出现多个细胞聚合，形成明显可见的细胞融合，而野生杆状病毒感染Sf9细胞仅出现细胞变圆病变，但没有细胞间融合现象，未感染正常细胞则有较多的细胞分裂相(图5)。
• 图5 重组杆状病毒表达的F 蛋白的细胞融合作用
•
Fig. 5 Fusion activity of F protein expressed in Sf9 cells infected with rBac-NDF
A: post-infection 120h with rBac-NDF; B: post-infection 120h with wild baculovirus; C: Normal sf9 cells without infection
2.5 特异性抗NDV 抗血清能识别F 基因表达产物
以NDV 多抗血清为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 为二抗，TMB 显进行Western blot 分析，结果发
现，在分子量60kDa 左右出现一条特异性带，说明抗NDV 多抗血清能特异性识别F 基因表达产物，进一步证实了NDV F 基因在杆状病毒表达系统中获得了表达（图6）。
2.6 重组杆状病毒表达的F蛋白能诱导机体产生特
异性中和抗体
用重组杆状病毒和野生杆状病毒感染的sf9细胞经腹腔免疫小鼠，免疫量为每次150万个细胞，三免后进行间接免疫荧光检测。结果用重组杆状病毒感染的sf9细胞免疫的小鼠血清有 明显的荧光反应，而野生杆状病毒感染的小鼠血清没有检出特异性荧光。免疫小鼠血清分别以1:25，1:50，1:100，1:200, 1:400, 1:800稀释，与200 TCID 50 NDV F48E8株等量混合感染鸡胚成纤维细胞 (Chicken embryo fibroblasts, CEF)，测得对CEF 的半数保护量（PD 50）
为10-2.24，说明重组杆状病毒表达的F 蛋白具有良好的免疫原性，能诱导产生特异性中和抗体。
图6 SDS-PAGE 和Western-blot 分析
Fig.6 SDS-PAGE and Western-blot analysis for F protein
expressed in insect cells
1/2, SDS-PAGE; 3/4, Western-blot; 5, Protein Maker ；1, 4, Recombinant baculovirus; 2, 3, Wild baculovirus.
3 讨论盲蝽科
新城疫是危害养禽业的最主要的传染病之一，免疫接种是我国控制新城疫的主要措施[9]。F 蛋白作
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为NDV 的最主要保护性抗原，一直是构建DV亚单位疫苗和重组疫苗的研究热点。本研究选用我国标准强毒株F48E8株F基因为目的基因，并用Bac-to-Bac 系统成功表达了F 蛋白，为研究F 蛋白的生物学功能和新城疫活病毒载体疫苗奠定了良好的基础。
细胞融合是胞饮、膜代谢、病毒穿入、细胞间信息传递的重要生物学过程，而对新城疫病毒来说，细胞融合则是侵入宿主的一个非常重要的步骤，也是其毒力表现的象征。本研究用杆状病毒表达了我国标准强毒F48E8株的F蛋白，间接荧光检测发现表达的F蛋白主要分泌在昆虫细胞膜，并在重组杆状病毒感染96h，感染细胞出现融合，这种融合作用显然没有HN蛋白的参与。Deng 等则报道了NDV F和HN的相互作用导致宿主细胞发生融合，认为HN 吸附细胞后产生了一种信息传递，使F蛋白空间构型发生改变，从而显示出融合细胞的功能[15]。可见病毒蛋白的细胞融合作用是一个复杂的过程，这种
融合作用不仅与F蛋白本身的结构有关，而且与所处的pH值、胰酶的作用等有关。因此，研究病毒感染引起细胞融合的发生机理了解病毒的致病机理和感染具有重要的理论和实际意义，有关F蛋白的生物学作用正在深入研究。
F蛋白作为NDV 的最主要保护性抗原一直是新城疫疫苗研究的主要靶抗原，国内外用多种病毒载体表达了F蛋白，而重组病毒表达的F蛋白是否裂解成F1和F2对其免疫原性有很大影响[11~13]。Murakami等[14]研究证实，重组杆状病毒表达NDV F 蛋白分布在昆虫细胞的外膜上，强毒株的在昆虫细胞内可部分被裂解，而弱毒株的F蛋白在培养的昆虫细胞内不裂解，用强毒株的F蛋白作为亚单位疫苗免疫鸡能够提供完全保护。Kamiya N报道了无毒株的F蛋白的免疫保护性较差，而强毒株F 蛋白对鸡致死性攻击有完全保护作用[10]。本研究用重组杆状病毒感染的昆虫细胞免疫小鼠也证实了能诱导产生较高的特异性中和抗体，表明其具有良好的免疫原性，因此用其作为亚单位疫苗具有重要意义。
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