⼝蹄疫新型疫苗研究进展
⼝蹄疫(FMD)是⼀种发⽣于⽜、猪、⼭⽺和绵⽺在内的野⽣和家养偶蹄动物的⾼度传染病，可跨种传播。欧洲、⼀些南美洲和⾮洲国家已采取严格的⽣物安全措施如扑杀等，并强制接种疫苗，以根除或控制⼝蹄疫。但是，由于⼝蹄疫病毒在家养动物与野⽣动物之间流⾏病学特点复杂（包括病毒在宿主体内存活），导致⼝蹄疫很难控制。在有⼝蹄疫疫情的国家，为了消除和控制疫病，将不得不付出惨重的经济损失。 FMD难以消除和控制，为了控制疫情扩⼤，必须采取必要措施，例如进⾏根除或预防性疫苗接种，通过扑杀、限制移动等政策和⽣物安全措施。理想的⼝蹄疫疫苗具安全性⾼，⼀次接种可以获得快速持久的保护性免疫反应，成本低，并能够区分疫苗免疫和病毒感染。为了克服灭活疫苗的缺点，⼈们开发了DNA疫苗、合成肽疫苗、活载体疫苗等新型疫苗。但是每种疫苗都有其⾃⾝的优势和局限性。⽽在实施⼝蹄疫根除策略时，疫苗区分感染和免疫的能⼒显得尤为重要；在疫苗紧急免疫时，最关⼼的关键的问题是，第⼀次免疫是否可以迅速诱导免疫反应。⼤多数新型疫苗如：新型减毒活载体疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗都能安全⽣产，并具有区分免疫接种和病毒感染的能⼒。除了DNA疫苗(与其他基因组有⼩概率重组的可能)和弱毒疫苗(毒⼒有可能恢复)之外，所有这些疫苗免疫动物都没有⼤的⽣物安全风险。本⽂主要概述这些⼝蹄疫常⽤疫苗及新型疫苗的最新研究进展。 1.灭活疫苗
⼝蹄疫商业疫苗主要是⽤⼆⼄烯亚胺(BEI)处理的灭活疫苗。这些疫苗⼀般有单价、⼆价、或者是多价。按照佐剂的不同可以分为油乳剂灭活疫苗、⽔性灭活疫苗和铝佐剂灭活疫苗等。FMDV抗原经浓缩后可在液氮中长期保存。灭活疫苗⼀般浓缩为三倍的半数保护剂量(PD50)的，为了更⾼的保护效⼒也有公司浓缩到六倍的PD50。这种⾼浓缩、⾼效⼒的疫苗主要⽤于⽆⼝蹄疫疫情国家的紧急免疫接种。抗原的种类、应⽤的⽬的和制造商等因素是决定抗原量和浓度的主要因素。这种⾼度浓缩的疫苗可以在⼀周内产⽣免疫保护反应，⽽⼤多数专家建议前两次免疫应该间隔⼀个⽉，然后每4~6个⽉免疫⼀次，两年后每年加强免疫⼀次即可。⽬前使⽤的灭活疫苗主要缺点包括：需要⽣物安全防护三级实验室⽣产，以防⽌疫苗⽣产过程中活病毒的逃逸；需要含有不同的⾎清型（这可能会造成动物免疫系统的压⼒）；需要冷链运输（⼝蹄疫病毒是⼀种热敏感病毒）。
⽤BEI灭活的⼝蹄疫疫苗免疫原性与⽤⼄亚胺或N-⼄酰⼄亚胺灭活疫苗的免疫原性相当。但是，⽤BEI灭活⼝蹄疫病毒时造成的危害远⼩于纯⼄亚胺或N-⼄酰⼄亚胺带来的危害。此外，甲醛灭活也是安全的。还有⼀种灭活⽅法是使⽤病毒相关核酸内切酶，研究发现⽤内切酶灭活的疫苗免疫豚⿏，其⾎清效价⾼于⽤BEI或甲醛灭活的疫苗。⾮化学静⽔压(HP)灭活可能也是⼀种简单、廉价、安全和可重复的病毒疫苗⽣产⽅法。
2.弱毒疫苗
⼝蹄疫病毒可以通过传统的细胞培养⽅法，或者利⽤分⼦⽣物学技术等新技术优化或删除⼀些基因，从⽽减弱⼝蹄疫病毒毒⼒。BHK-21细胞已⽤于制备⼝蹄疫⼩⿏减毒活疫苗，⽤于⽜的免疫。1969年后，对BHK-21细胞进⾏了修饰和克隆。在⼀项研究中，除了⼀只免疫动物有发烧之外，⼝蹄疫减毒活疫苗被证明可以保护绝⼤部分动物免受FMDV的损害。 新减毒⼝蹄疫疫苗株被认为⽐以前的毒株更稳定，他们毒⼒恢复的风险要远⼩于传统的减毒活疫苗。毒⼒基因的确定对于开发出更好的减毒活疫苗⾄关重要。这些毒⼒决定因素之⼀是病毒前导蛋⽩酶，它抑制β⼲扰素mRNA的诱导，并阻⽌宿主动物的先天免疫。该蛋⽩酶基因的缺失可使FMDV在猪和⽜体内毒⼒消失，⽽这种基因阅读框的移位也导致⼝蹄疫病毒在⽜体内毒⼒减弱。既没有前导蛋⽩酶基因缺失也没有移位的⼝蹄疫疫苗在雾化吸⼊后可能会引起病毒⾎症或临床症状，但前导蛋⽩酶基因缺失疫苗⽐前导蛋⽩酶基因移位疫苗传播⼒更低。此外，研究表明有部分前导蛋⽩酶基因缺失疫苗可能会发⽣毒⼒返强。
各种新型的技术已被⽤于⼝蹄疫病毒毒⼒的弱化，包括构建前导蛋⽩酶基因缺失毒株(LLV)。第⼀，删除Lpro，这株变异株能诱导猪和⽜产⽣强的抗体反应，但是不能保护猪和⽜免受病毒攻击；第⼆，切除Lpro中保守的SAP序列，它可以使得动物在免疫后两天产⽣保护性免疫反应，保护猪免受同源毒株的侵袭。⽜⿐炎病毒B型（BRVB）的LPro与FMDV 的LPro极度相似，研究⼈员将⽜⿐炎病毒B型（BRVB）LPro嵌合到FMDV产⽣的突变毒株在⽜胚胎肾细胞系中可诱导产⽣⾼⽔平的⼲扰素刺激基
因(ISGs)，它能影响抗病毒应答的mRNA⽔平，但是这需要更多的体内研究。嵌合病毒在⽜
产⽣⾼⽔平的⼲扰素刺激基因(ISGs)，它能影响抗病毒应答的mRNA⽔平，但是这需要更多的体内研究。嵌合病毒在⽜体内毒⼒可被弱化，但在猪中仍表现出低⽔平的毒⼒，它可以诱导产⽣较强的保护性免疫反应，从⽽起到抵抗同源毒株侵袭的作⽤。另⼀种弱化⼝蹄疫病毒毒⼒的策略是密码⼦优化。这些新⽅法制备的⼝蹄疫弱毒苗可以在⼩⿏和猪体内诱导产⽣⾼滴度的中和抗体。
3.DNA 疫苗
DNA疫苗通常是含有⽬的基因序列的重组质粒疫苗，它在启动⼦的控制下进⾏基因表达，并产⽣免疫应答。DNA疫苗的主要特点是：既能刺激T细胞反应，⼜能刺激B细胞反应。2)不会对免疫动物的免疫系统造成压⼒。(3)没有感染因⼦，使⽤安全。4)易于⽣产。(5)⽐较稳定，不需要冷藏设备。6)可以包含具有DIVA功能的标记基因，⼜可以进⾏野毒株基因序列的快速修改，还可以包含多个抗原性位点。DNA疫苗的主要挑战是使⽤剂量要⼤，⾜够量的DNA疫苗才能诱导较好的免疫效果。DNA疫苗缺点主要有：1）诱导的抗体有可能针对宿主⾃⾝DNA。2）它们被⽤来翻译⽬的蛋⽩抗原，⽽不是脂多糖抗原。免疫后，质粒DNA被宿主细胞摄取，然后进⾏病毒蛋⽩表达，表达的蛋⽩被传递到内质⽹，然后被细胞蛋⽩酶切割成多肽，这些多肽随后被内质⽹上中的MHCⅠ转运，并呈现在细胞表⾯，从⽽导致免疫应答。
DNA疫苗的主要缺点是使⽤⾜够的剂量才能达到保护效果。
DNA疫苗的⽬前的新进展包括修饰FMDV基因表达B细胞表位和T细胞表位以引导抗原递呈细胞(APC)提供完整免疫保护。将Bcl-XL抗凋亡蛋⽩与⼝蹄疫病毒T细胞和B细胞表位共表达可以提⾼T细胞免疫，这在疫苗研发中有很⼤潜⼒。此外，研究表明单个质粒往往⽐与多个质粒的组合能提供更强的免疫⼒。当使⽤多个质粒时，在实际应⽤之前需要仔细评估。环境温度的变化也会影响DNA疫苗的免疫效果。慢性热应激(CHS)对⼝蹄疫病毒DNA疫苗的免疫应答有负⾯影响，会严重损害细胞免疫应答。
经过⼤量试验证明，细胞因⼦是DNA疫苗的有效佐剂。⽩介素(Interleukins)对DNA疫苗的效⼒有重要的影响，能有效增强免疫应答反应。例如，IL-6增强细胞免疫应答并促进树突状细胞成熟及其免疫功能，IL-9增强抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应（CTL），IL-15增强黏膜和细胞免疫应答以及⼝蹄疫核酸疫苗诱导的γ-⼲扰素的产⽣，IL-18增强疫苗的免疫原性，CSF能增强免疫反应，α/β-INF增强细胞免疫应答和促进树突状细胞成熟及其免疫功能，γ-IFN增强细胞免疫和体液免疫，IL-1和IL-2促进抗体应答。
4.多肽疫苗
多肽疫苗由⼀条含有⼝蹄疫病毒⾐壳蛋⽩或T细胞和/或B细胞表位的线性多肽。与灭活疫苗相⽐，多肽疫苗具有⽣产成本低、稳定性好、易于⼤规模⽣产等优点，并且在⽣产过程中不需要使⽤传染性的
⼝蹄疫活病毒。⼤多数合成肽疫苗依赖于载体蛋⽩，如卵清蛋⽩或细菌类毒素等。这些载体必须符合效⼒和安全标准，并易⼤规模⽣产，以及⽣产成本低廉。
起初研究⼈员所使⽤的多肽为VP1的C末端(残基200-213)或包含B细胞表位(残基141-160)的G-H环，但这些多肽在动物攻毒实验中没有⾜够的保护作⽤，只能诱导有限的T细胞反应。保护效⼒和免疫反应低可能是由于G-H环域的⾼突变性。之后，通过对B细胞表位和T细胞表位添加⼈⼯T细胞辅助位点和延长两端序列的⽅法进⾏了优化，⽐与单⼀多肽的免疫原性更强。将⼀个FMDV T细胞表位插⼊到四个B细胞表位中的树状⼤分⼦设计理念构建的多肽苗免疫猪和⽜具有完全的保护作⽤。⼀种⽤于预防猪⼝蹄疫的商品化⼝蹄疫合成肽疫苗(UBITh®疫苗)是由联合⽣物医学公司(UBI)⽣产的，已获准在台湾和中国⼤陆使⽤。有研究团队将 5个串联的B细胞表位(VP1残基136-162)和⼀个T细胞表位(3A残基21-35)嵌合重组称“5BT”，经研究证明它能在⼩⿏体内诱导产⽣抗体。树状⼤分⼦多肽B4T和B2T可以在⽜体内引起特异性体液免疫应答，并对异源毒株有部分保护作⽤。B4T和B2T多肽同样可以诱导较⾼⽔平的T细胞反应，所有动物⾎清和粘膜中均能检测出较⾼⽔平的IgG1，⽤B4T免疫的动物有40%产⽣IgA抗体，B2T免疫有20%产⽣IgA抗体。 A型FMDV VP1蛋⽩的构象中和表位135YxxPxxxxGDLG147可以⽤于表位疫苗的鉴定诊断。
5.活病毒载体疫苗
使⽤病毒载体可以轻松地实现抗原基因的传递，并通过它们在载体感染细胞中表达的抗原蛋⽩来激发细胞免疫的和体液免疫。这些病毒载体常作为抗原序列的运输⼯具，它们有痘苗病毒、鸡痘病毒、伪狂⽝病病毒、α病毒、复制缺陷⼈腺病毒和Semliki森林病毒。含有FMDV P1基因组的重组仙台病毒可诱导⼩⿏产⽣⾼⽔平的特异性体液免疫和细胞免疫。⽵花叶病毒也被⽤作表达FMDV表位的载体，表达FMDV表位的重组⽵花叶病毒疫苗可以诱导猪保护性免疫。表达FMDV表位的重组⽜传染性⿐⽓管炎病毒(IBRV)疫苗能诱导⽜产⽣抗FMDV的保护性免疫应答，并保护其免受强毒IBRV 的攻击。研究⼈员还⽤⽜肠道病毒作为载体表达FMDV表位，但是⽬前还没有进⾏攻毒实验。在兔⼦模型中，含有⼝蹄疫病毒VP1基因的Ⅰ型重组⽜疱疹病毒可以诱导产⽣较⾼⽔平的中和抗体。腺病毒载体表达的FMDV亚单位疫苗能够保护所有免疫动物免受FMDV侵染。经过⼤量的⽜体内安全性评估研究，复制缺陷型AdtA24疫苗达到了美国监管要求的安全相关规范。这些腺病毒载体疫苗最⼤优点是DIVA能⼒和诱导细胞免疫和体液免疫的能⼒。并且它们可以⼤规模⽣产，
相关规范。这些腺病毒载体疫苗最⼤优点是DIVA能⼒和诱导细胞免疫和体液免疫的能⼒。并且它们可以⼤规模⽣产，成本较低，减轻兽医部门的经济负担，⽣产不需要很⾼的⽣物安全等级，⽽且它们的基因稳定。
值得注意的是，对于不同⾎清型FMDV，单价活载体疫苗通常提供了⽐⼆价病毒载体疫苗更⾼⽔平的体液免疫。⽤⼆价疫苗Ad5A24+O1免疫猪产⽣了抗O1和A24的中和抗体(NA)，但抗体产⽣的总体⽔
平明显低于Ad5-A24单价疫苗或商品化的FMD疫苗。
适当的佐剂对病毒载体疫苗效⼒有着重要的影响。poly （ICLC）和α-⼲扰素可以增强Ad-FMD载体疫苗免疫保护效⼒，并能降低疫苗使⽤的最⼩保护剂量。Enabl®佐剂可以降低AdtA24载体疫苗的保护剂量；在强毒攻击时，它可以有效保护 AdtA24载体疫苗免疫后7天或者14天的⽜，预防⼝蹄疫损伤的临床症状的发展。徐胖胖
值得注意的是所有为预防⼝蹄疫⽽开发的实验性病毒载体疫苗，要么只是对⽜或猪部分保护，要么还没有在其⾃然宿主中进⾏验证。但是不同于其他病毒载体，复制缺陷型⼈腺病毒载体有⼀种被批准⽤于紧急免疫，并已被证明，这种疫苗可以诱导完整的免疫反应。
6.病毒样颗粒(VLP)
真核表达系统和原核表达系统等其它表达系统，常常被⽤来制备病毒样颗粒(VLPs)。VLPs只包括FMDV的⾐壳蛋⽩，⽽不具有传染性基因组。杆状病毒/昆⾍细胞表达系统以及细菌、植物和幼⾍等系统常被⽤作制备VLPs。
细菌毒素融合蛋⽩在⿐腔给药后可诱导豚⿏产⽣针对FMDV抗原的黏膜免疫。将表达FMDV表位的基因与⼄型肝炎病毒核⼼颗粒融合为⼀个复合结构，⽤转基因烟草表达的这个复合结构也可以保护⼩⿏。
构建VLPs及其增强FMDV多表位融合的⼄肝病毒修饰核⼼颗粒的免疫原性⼯作已经完成。已经证明，MS2介导的⼝蹄疫VLP疫苗对猪、⼩⿏和豚⿏有保护作⽤。以嵌合兔出⾎症病毒(RHDVVLP)作为载体构建的RHDV-VLPs，可诱导猪淋巴细胞特异性T细胞反应，并诱导⼤量的抗3A表位和RHDV-VLPs的γ-⼲扰素分泌细胞。此外，研究⼈员还构建了含有FMDV多聚蛋⽩P1的转基因苜蓿植株，并将其作为实验性免疫原。⽤烟草坏死病毒A构建的纯化嵌合病毒颗粒(CVPS)经肌⾁注射可产⽣对FMDV的强烈免疫应答，⿐腔接种可诱导⼩⿏产⽣系统免疫和粘膜免疫。⼝服利⽤T4噬菌体展⽰技术表达FMDV⾐壳蛋⽩制备的疫苗表达可以100%保护⼩⿏免受FMDV攻击。转基因绿藻的叶绿体也被⽤作黏膜疫苗的制备。⼀种⼩泛素样修饰物(SUMO)融合蛋⽩系统利⽤⼤肠杆菌表达VP0、VP1和VP3，，可以保护豚⿏、⽜和猪免受FMDV攻击。如上所述，⼀些研究已经利⽤植物，包括苜蓿、烟草和番茄作为VLP⽣产的平台。⾷⽤植物的使⽤使疫苗的传递变得简单。许多研究表明，这些疫苗在⼩⿏模型中有保护作⽤，但在⾃然宿主中这些疫苗的效⼒尚未被验证。
7.标记疫苗
病毒抗原的纯化清除了⾮结构蛋⽩NPs，使受感染的动物能够被从免疫动物中区别出来。因此，将纯化疫苗与检测抗NP抗体的试验相结合，从根本上提供了⼀个合适的疫苗/诊断标记系统。当需要控制疫情和筛选免疫动物以确定病原携带者时，使⽤这些现代疫苗是⾮常重要的。纯化的FMDV疫苗中缺少2C蛋⽩，这为区分康复和免疫动物提供了基础。
许多疫苗结合相应的诊断试剂作为标记疫苗系统使⽤，例如嵌合FMDV疫苗、仅有部分VP1的 G-H环疫苗、FMD反向标记疫苗，、RGD-4中插⼊FLAG标记的疫苗、Cav-P1 / 3C R°FMDV疫苗，以被截短3AB的病毒作为相应的诊断试剂；含有Lpro和删除其中⼀个3B蛋⽩的候选标记疫苗（A24LL3DYR和A24LL3BPVKV3DYR）、r3AB1-FMDVNSP疫苗、以缺失3AB NSP区域的病毒作为对应的诊断试剂；⽽抗NSP主要和保守的“AEKNPLE”表位的单克隆抗体⽤作DIVA 检测试剂。
8.展望
反向遗传学和感染性cDNA技术的不断发展为⼝蹄疫疫苗的研发带来了⼀场⾰命。第⼀，结合病毒免疫学和病理学研究发展，对发病过程进⼀步了解，对⼝蹄疫疫苗改进⾄关重要。第⼆，利⽤反向遗传学和计算⽣物学⼯具优化的⾐壳蛋⽩疫苗更加稳定，抗原匹配性更强，并具有DIVA能⼒和⽣物安全性，理论上可以获得安全有效的疫苗。第三，基因⼯程和重组DNA技术的进步促进了亚单位疫苗的发展。第四，新型佐剂的最新成果在⼝蹄疫疫苗中的应⽤，提⾼了疫苗的免疫原性，甚⾄延长保护持续期。第五，抗原⾄抗原递呈细胞（尤其是树突状细胞）的递呈过程研究也有了进⼀步的进展。通过抗原表位与单克隆抗体或特异性配体（表达在APCs表⾯的特殊受体）藕联，可以激活抗原到⽬标树突细胞或者其它抗原递呈细胞的递呈过程。
研发部邓瑞雪编审李冬
⾮洲猪瘟检测技术研究进展
⾮洲猪瘟检测技术研究进展
⾮洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由⾮洲猪瘟病毒（African swine fever virus ，ASFV）引起家猪和野猪的⼀种以⾼热、⽹状内⽪系统出⾎、为主要特征的烈性传染病，世界动物卫⽣组织（OIE）将其列为法定必须上报动物疫病，我国也将其列为⼀类动物疫病。
ASFV是⾮洲猪瘟病毒科的唯⼀成员，同时兼具有虹彩病毒和痘病毒的⼀些特性。它仅有1个⾎清型，24个基因亚型，根据⾎细胞吸附特性⼜划分为8个⾎清。据报道，⽬前我国分离的ASFV主要为基因2型。ASFV常在单核巨噬细胞及⽹状内⽪细胞中复制，也能在钝缘软蜱中增殖，最急性型和急性型病死率⾼达100%。该病毒基因组约为170kb-
192kb，属于单分⼦线状双链DNA。
ASFV多年来持续在波兰、乌克兰、⽐利时、南⾮、俄罗斯、保加利亚等国家发⽣，我国⾃2018年8⽉在沈阳确诊第⼀起ASF以来，全国各省市区（港澳台除外）均报道了不同规模的疫情。⽬前，针对ASF尚⽆有效的疫苗和药物，为了防⽌疫情在国内蔓延，维护养猪业健康发展和⾷品安全，我国主要采取了扑杀感染动物、封锁疫区、限制⽣猪调运、强化⽣物安全措施和快速检测技术等疫病防控
措施。其中，ASFV检测技术的研究与应⽤对该疫病的防控措施的制定及实施将起到重要作⽤。本⽂重点对⼏种ASFV病原学检测技术的研究进展进⾏介绍，为ASF的快速诊断和综合防控提供依据。
品牌研究1. 红细胞吸附试验（Hemadsorption, HAD）
HAD试验的原理为猪红细胞能够吸附在感染了ASFV的猪巨噬细胞或单核细胞表⾯，只有极个别的ASFV没有吸附猪⾎细胞的能⼒。该试验通过⽤猪⾎液或组织悬液接种原代⽩细胞或猪肺泡巨噬细胞，也可以制备感染猪的外周⾎细胞培养物进⾏“⾃⾝玫瑰花环”⾎细胞吸附试验，镜检以出现红细胞吸附在感染细胞的表⾯，呈现出玫瑰花环或桑葚状判定为ASFV阳性。ASFV的红细胞吸附特性可以被特异性抗体阻断，红细胞吸附抑制试验（hemadsorption
inhibition，HADI）可⽤来滴定抗体效价或⽤来鉴别ASFV不同毒株之间的抗原差异性。HAD试验观察的时间取决于所采集病料中病毒的载量，通常得出结果需要7天左右。
2. 病毒的分离培养与鉴定
病毒的分离培养与鉴定是OIE推荐使⽤ASFV检测的⾦标准技术。但ASFV没有很好的细胞系进⾏分离培养，必须使⽤原代细胞（猪原代肺泡巨噬细胞）进⾏分离培养，此外，由于原代细胞培养物制备过程繁琐、试验周期长，⽬前此检测⽅法仅⽤于实验室研究和确诊，⽽不是临床上快速检测ASFV的⾸选技术。
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3. 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）
PCR是OIE官⽅推荐使⽤检测ASFV的技术，该⽅法具有对病原DNA纯度要求低、操作简便、敏感性⾼、特异性强等优势，可⽤于检测体外分离不出来或者对HAD敏感性差的病原体。该检测技术是选择ASFV 的保守基因序列设计出特异的上下游引物，利⽤DNA聚合酶进⾏PCR扩增反应，之后再通过核酸凝胶电泳进⾏ASFV基因检测的⼀种技术。中国农业科学院兰州兽医研究所杨吉飞等⼈基于ASFV VP72基因建⽴了的PCR检测⽅法，并对欧盟ASF参考实验室提供的17份ASFV基因组进⾏检测均为阳性。⽬前，该检测技术已经被⼴泛应⽤于ASF的临床监测，可以快速检测和区分各分离毒株，该检测技术适⽤于⾮疫区或者⽆家的疫情监控及⼈员、交通⼯具、商品贸易等通关检疫。
4. 实时荧光定量PCR检测技术（Quantitative real-time PCR，qPCR）
该检测技术与传统的PCR检测技术相⽐，其敏感性⽐传统PCR更⾼，检测结果更准确、重复性好、稳定性强，并且可以避免反复打开样品盖造成的⽓溶胶污染和溴⼄锭（EB）对检测⼈员的损害。2019年6⽉11⽇，中国农业农村部公布了第⼆批ASF现场快速检测试剂，其中包括26家单位的34个产品，主要分为荧光定量PCR类试剂盒和等温扩增类两⼤类型。以中国农业科学院兰州兽医研究研制⽣产的试剂盒（⾮洲猪瘟病毒直接扩增qPCR抗原检测试剂盒）为例，该产品涉及两个过程，第⼀个过程是分采⽤裂解的⽅法快速释放样本DNA；第⼆个过程是针对ASFV 设计合成了⼀对特异性引物以及⼀条
带有FAM荧光基团的探针。该检测技术具有速度快、灵敏度⾼、污染风险⼩、可定量分析等优势，对实际排查和快速确诊ASFV具有较⾼的应⽤价值。
5. 环介导等温扩增检测技术（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）
LAMP检测技术是⼀种新型检测技术。该检测技术作为⼀种基因扩增技术，具有⾼灵敏性、⾼特异性、简单易操作、成本低等特点，并且检测不受仪器设备的限制，能最⼤限度的满⾜基层快速诊断的需要。LAMP检测⽅法特异性可达100%。这种简单、快速、准确、廉价的在等温条件下进⾏的基因扩增技术还具有现场分析⾼度兼容的特性。
100%。这种简单、快速、准确、廉价的在等温条件下进⾏的基因扩增技术还具有现场分析⾼度兼容的特性。
6. 重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase polymerase amplification，RPA）
RPA是近年来在分⼦⽣物学领域发展最快的技术之⼀，该技术虽然起步晚，但却在⽣产实践和临床检测中得到了⼤量的推⼴和应⽤。⽬前RPA技术已被⼴泛应⽤于病原微⽣物的检测，包括细菌、病毒、寄⽣⾍、⽀原体等在内的主要⼈类病原体以及⼀些重⼤的动物疫病病原体，还被应⽤于肿瘤、癌症⽅⾯的研究和快速检测。该检测技术的作⽤原理为重组酶寡核苷酸引物与⽬标同源序列进⾏配对，经退⽕之后，单链DNA结合蛋⽩（Single stranded DNA binding
2013苏迪曼杯protein，SSB）与移位的单链DNA链特异性结合，防⽌引物发⽣游离，当扩增进⾏到探针上的碱基位点时，能够被核酸外切酶识别并发⽣剪切，使得荧光基团和猝灭基团彼此分离，形成⼤量的荧光信号，进⽽聚集产⽣特异的⾁眼可观察的荧光产物，通过荧光颜⾊的强弱、差异来判定检测样本的阴阳性。
铜仁社区
7. 微滴数字PCR检测技术（Droplet digital PCR，ddPCR）
细菌分析ddPCR是不需要设置标准品就可以对⼀定体积油滴中的靶核酸分⼦进⾏绝对定量的⼀种新型检测⽅法，灵敏度可达单个拷贝数，能够精确区分出浓度差异甚微的核酸样品。在⼈类医学应⽤上，由于ddPCR检测技术具有⾼敏感性和⾼特异性，已经被⼴泛应⽤于⼈类医学上，成为检测多种癌症基因最准确可靠的技术之⼀。
8. ⼩结
⽬前，我国防控ASF的形势依然⾮常严峻。因此，迫切需要快捷简便、准确客观、⾼灵敏度、⾼特异性的ASFV检测技术对养猪业的饲养、运输、屠宰、加⼯、销售、废弃物处理、⼈员车辆流通等各个环节以及猪⽤⽣物制品实施更⾼效的排查⼿段。此外，为了不使⽤具有感染性的ASFV进⾏相关试验，防⽌病原的再次传播，许多研究⼈员提出⽤构建重组蛋⽩策略展开更深⼊的病原学研究、开发新型检测技术和研制⾼效疫苗，极⼒为ASF的综合防控和净化⼯作提供技术⽀撑。
质量管理部张涛编审李冬
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