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犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立

Classified Index：Code：10224 Confidential (yes/no)：no No.150610522

Dissertation for the Master Degree

Isolation and Identification of Canine Distemper Virus and Establishment of

Indirect Agglutination Test for the

Detection of Its Antibody

Candidate: Su Ruihong

Supervisor: Prof. Shi Dongfang

Degree Category: Master of Agriculture

College: College of Veterinary Medicine

First level discipline: Veterinary Medicine

ad590Second level discipline: Preventive Veterinary Medicine

Harbin China

June 2018

摘要 ......................................................................................................................................... I 英文摘要................................................................................................................................ I II 1 引言.. (1)

童话屋

1.1 犬瘟热和犬瘟热病毒概述 (1)

1.1.1 犬瘟热 (1)

1.1.2 犬瘟热病毒形态和理化特性 (1)

1.1.3 犬瘟热病毒分类及其基因组结构 (1)

1.1.4 犬瘟热病毒的分离培养 (3)

1.1.5 犬瘟热病毒的鉴定 (4)

1.2 犬瘟热的防治 (5)

1.2.1 犬瘟热疫苗免疫接种 (5)

1.2.2 犬瘟热临床 (6)

1.3 犬瘟热疫苗免疫抗体的检测方法 (6)

1.3.1 血清中和试验（SN） (6)

1.3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） (7)

1.4 凝集试验 (7)

1.4.1 直接凝集试验 (7)

1.4.2 间接凝集试验 (7)

studioclassroom1.5 纳米微球在疾病检测领域的应用 (7)

1.5.1 纳米微球的种类 (7)

1.5.2 纳米微球在疾病检测领域的应用 (8)

1.5.3 纳米微球致敏技术 (8)

1.6 研究目的与意义 (8)

2 材料与方法 (10)

2.1 材料 (10)

2.1.1 菌毒株、质粒、实验动物 (10)

2.1.2 主要试剂、培养基和耗材 (10)

2.1.3 病料和血清 (10)

2.1.4 实验仪器 (11)

2.2 方法 (11)

2.2.1 犬瘟热病毒的分离鉴定 (11)

2.2.2 犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析 (12)

2.2.3 犬瘟热疫苗免疫犬血清抗体检测 (13)

2.2.4 重组CDV H蛋白的表达 (14)

2.2.5 重组蛋白的纯化 (15)

2.2.6 重组蛋白的Western-blot鉴定 (15)

2.2.7 重组蛋白免疫原性比较 (15)

2.2.8 CDV抗体检测间接凝集试验的建立 (16)

2.2.9 CDV抗体检测间接凝集试验的初步应用 (17)

3 结果 (18)

3.1 CDV分离鉴定 (18)

3.1.1 细胞病变 (18)

3.1.2 电镜观察 (18)

3.1.3 RT-PCR鉴定 (19)

3.1.4 间接免疫荧光鉴定 (19)

3.2 CDV H基因克隆及序列分析 (20)

3.2.1 CDV H基因的扩增 (20)

3.2.2 CDV H基因核苷酸序列分析 (21)

3.2.3 CDV H基因氨基酸的序列分析 (23)

3.2.4 H蛋白的糖基化位点预测 (24)

3.2.5 分离毒株与疫苗毒株H蛋白抗原表位分析 (25)

火焰山来的鼓手3.3 CDV疫苗免疫犬血清抗体检测 (26)

3.3.1 CDV TCID50测定 (26)

3.3.2 免疫犬血清中和试验 (26)

3.3.3 商品试剂盒检测犬血清抗体 (27)

3.4 重组CDV H蛋白的表达 (27)

3.4.1 CDV H基因的分段克隆 (27)

3.4.2 重组菌的构建 (27)

3.4.3 重组蛋白的表达 (29)

3.5 重组蛋白的纯化和免疫原性鉴定 (29)

3.5.1 重组蛋白的纯化 (29)

w3c3.5.2 Western-blot免疫原性鉴定 (30)

3.6 重组蛋白免疫原性比较 (31)

3.6.1 免疫抗体检测 (31)

菅义伟为什么只有一年

3.6.2 细胞中和试验 (31)

3.7 CDV抗体检测间接凝集试验的建立 (32)

3.7.1 聚苯乙烯微球致敏条件优化 (32)

3.7.2 CDV抗体检测间接凝集试验阳性标准确立 (33)

3.7.3 凝集反应的特异性和敏感性试验 (34)

3.7.4 凝集反应的重复性和稳定性试验 (35)

3.7.5 犬瘟热病毒抗体检测间接凝集试验的初步应用 (36)

4 讨论 (38)

4.1 犬瘟热病毒分离病料选取 (38)

4.2 犬瘟热病毒的细胞分离培养 (38)

4.3 犬瘟热毒株的遗传变异 (39)

4.4 用于致敏纳米微球的重组蛋白的选择 (39)

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