一作详解Cell丨通过抑制代谢冗余元件达到在特定微环境下抑制免疫细胞的功能 细胞代谢是一切生命体得以存在的基础。细胞从环境中获取营养物质，通过一系列的酶活反应，将营养物质转化为支持细胞各种功能的代谢产物。这其中包括生命科学里耳熟能详的代谢产物，譬如氨基酸、核苷酸、脂肪酸、能量分子ATP，也有一些教科书上经常看到的，最近研究的也比较多的分子，例如乙酰辅酶A等，更多的则是平时鲜有机会见到的分子。穿刺针
我们所知道的所有细胞活动，譬如DNA合成、蛋白质合成、表观调控、各种信号通路的激活传递、细胞之间的通信等全部依托于细胞代谢所产生的代谢产物，所以很长一段时间以来，细胞代谢被看作是细胞的后勤部门——细胞需要什么，后勤部门就提供什么来满足细胞的要求。最近许多观点更是认为细胞代谢不仅仅是作为各个细胞功能的后勤部门，它其实可以在某种程度上决定了细胞的功能，譬如表观遗传可以直接被细胞内各种相关代谢物的浓度所影响，从而进一步影响细胞功能【1】。正是因为代谢在调控细胞功能中的重要作用，通过药物手段调节细胞代谢活性是一种有效的抑制致病细胞的手段。毕竟，不管失活的是后勤部门还是主管部门，细胞都不可能再进行正常的细胞活动。这就是为什么大家能看到越来越多的关于代谢的研究出现在生命科学和医学的各个领域的原因之一。
然而，也正是因为细胞代谢对每个细胞的重要性，抑制细胞代谢会造成无差别杀伤——不仅是致病细胞被抑制，那些维持人体正常功能的健康细胞也可能会被抑制。这其实是目前关于代谢研究的一个大问题。从制药的角度去看，除非药物可以给到体内的特定细胞，否则这些方法必然会大大受制于毒副作用。一个比较著名的例子是Gapdh抑制剂3-bromopyruvate【2】。Gapdh是糖酵解通路中的一个酶。糖酵解几乎在每个细胞中都存在。它以葡萄糖为底物，为细胞提供生存的各种基本物质 （氨基酸、脂肪酸、核苷酸、ATP等等）。正是因为糖酵解的重要功能，在许多快速分裂的细胞中，它的活性都大大加强了，譬如肿瘤细胞和T淋巴细胞【3】。也正是因为这个原因，抑制糖酵解被认为是一种可以抑制肿瘤生长的手段。Gapdh抑制剂3-bromopyruvate也是由于这个原因在德国被应用在肿瘤病人身上，但是不幸的是，这种药物导致了3个病人的死亡。考虑到糖酵解通路的重要性，这种结果其实并不意外。用这个例子其实想说明一点，通过药物抑制代谢通路来抑制致病细胞并不难——可能抑制任何一条重要的代谢通路都可以达到这种目的。但是这个问题的难点在于如何控制这种方法使得人体大部分正常细胞不会被影响。
特洛伊木马病毒
2020年7月1日，美国纽约大学医学院Dan R. Littman博士和武林肉蒲之极乐宝鉴博士在Cell上发表文章Niche-Selective Inhibition of Pathogenic Th17 Cells by Targeting Metabolic Redund
ancy，为解决这个问题提供了一个全新的思路。
细胞代谢通路在大部分人的印象中就像是一条条单独的地铁线，每一条线是一种独特的代谢通路，每一站代表一种代谢产物，两站之间的列车代表了催化该反应的酶，在某一地铁线的任何一处设置了路障都会把这条路给封死，就像把Gapdh抑制住就可以把整条糖酵解通路关闭一样。但是实际上，我们应该用网络的概念去看待代谢通路 （图1），就像现实生活中地铁线是交错在一起的。很多时候在某一条地铁线由于各种原因不通的情况下，我们还是可以乘坐其他地铁线到达目的地，虽然这可能会延长乘坐地铁的时间，增加换站的次数。和地铁网络一样，在代谢网络里，有一些代谢产物是可以被多条通路合成和利用的，当某一条合成这种代谢物的通路被阻断时，细胞还是可以利用其它的通路去合成这种物质。这种多条通路产生相同产物的现象在生命科学里称之为冗余（redundancy）。我们的研究发现，由于冗余通路的补偿作用，对抑制功能冗余的酶所产生的毒副作用要远远小于对相同通路内非冗余酶的抑制。另外一个重要的发现是，特定的生存环境会改变冗余通路的活性，导致在正常情况下冗余的通路变得不再冗余。相应的，在这种特定环境下将这种不再冗余的位点阻断的话会对细胞产生致命性的影响。将这两个发现放到一起，就是我们的研究提出的一个重要概念 - 通过抑制基于环境因素选择性冗余的酶达到（1）抑制处于
病灶环境中的致病细胞，和同时（2）降低对于健康组织细胞的毒副作用（图2）。
图1. 细胞中的“地铁线”。图片所展现的只是部分代谢通路。图片来源于Biochemistry 8th Edition
溴代环丙烷图2. 本研究的三个结论。（1）由于补偿元素的存在，对冗余代谢通路的抑制可以被许多细胞耐受。如山下两条冗余的通路，封住其中一条并不会影响上山的途径；（2）通路活性可以被环境因素影响，使得本来冗余的通路变得不再冗余。如山上的两条通路其中一条被大雪覆盖住，另外一条就是唯一的一条上山的路径；（3）利用这种选择性冗余的特点，阻断相同的通路可以选择性抑制特定环境下的致病细胞。如图中红路障牌放在山上和山下是两种不同的结果 – 在山上可以彻底阻断通路，在山下不会影响通路的运行。
研究手段和具体发现
我们研究的是一种叫做Th17的CD4+ T细胞亚型，这种亚型是从静息CD4+ T细胞分化而来。Th17细胞平时在我们体内维持组织的动态平衡以及保护我们不被真菌以及其它一些细菌感染【4-6】。但是也是这种细胞，被一些特定的原因激活后会导致许多自身免疫疾病的
发生，譬如慢性肠炎，银屑病，强制性脊柱炎等。我们称呼前者为非致病性Th17，后者为致病性Th17。由于两者都是Th17，他们有着相似的核心分化程序和细胞因子网络。目前为止，特异性的针对致病性Th17的方式是抑制其核心程序分子，譬如利用anti-IL23和anti-IL17抗体去阻断Th17的分化和功能【7-10】。这些方法会不可避免的抑制非致病性Th17的功能。目前还没有已知的方法去特异性的抑制致病性Th17，而不影响非致病性Th17。
为了研究如何特异性的抑制致病性Th17，我们首先比较了小鼠内两种细胞转录组的区别（致病性Th17是从EAE小鼠（研究多发性硬直的模型）的脊柱中分离获得，非致病性Th17是从SFB（segmented filamentous bacteria，一种存在在小肠中的共生细菌，会诱导非致病性Th17在small intestine lamina propria （SILP）的生成）感染的健康小鼠的SILP中分离获得）。同时，我们建立了一套基于CRISPR技术的在体内敲除静息CD4+ T细胞基因的方法。这种方法需要将抗原特异性并且表达Cas9的静息T细胞从供体小鼠中分离出来，使用电转技术将guide RNA序列导入细胞中，然后立即将细胞回输到实验小鼠中。这些回输的静息T细胞会和正常的抗原特异性细胞一样在体内进行分化，迁移和工作，唯一的不同是他们会在三天内变为基因敲除细胞。通过与同时回输的野生型对照细胞进行比较，我们
可以知道被敲除基因是如何在小鼠体内纯生理环境下调控T细胞的分化和功能。相比最近开始流行的利用病毒载体敲除基因的方法，我们的方法避免了体外培养、激活、标记筛选等一系列需要人工且繁琐的操作，因此其更加准确、可靠、和快速。
利用这种技术，我们敲除了一系列在致病性Th17中高表达的基因，最终发现敲除糖酵解通路中的Gpi1可以完全抑制致病性Th17细胞在EAE病灶位点的增殖，以及EAE的发生。在慢性肠炎中我们也观测到了相同的结果。更为重要的是，Gpi1的缺失并没有对存在于SILP的非致病性Th17有明显的影响。这个结果非常出乎意料，因为糖酵解通路一直被视为维持细胞生存的必须通路。之前关于T细胞的研究也报道了糖酵解通路对于T细胞增殖的重要作用【11,12】。与这些报道的结果一致，当我们敲除该通路中的其他基因，譬如Gapdh、Tpi1、Ldha1的时候，这两种Th17细胞都无法在体内存活。有意思的是，从以往文献和数据库中我们也发现了一些证据说明了Gpi1的特殊性。有许多病人天生就存在糖酵解酶的缺陷（大部分酶活丧失）。如果存在缺陷的基因没有同功酶，利如Tpi1和Pgk1，病人的神经发育，肌肉发育和血红细胞会有严重缺陷 (Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM] entry 190450, 311800)【13】。虽然Gpi1并没有同功酶，它的缺陷在绝大多数患者中并没有造成患者神经和肌肉的异常，只是造成了不同程度的贫血症状【14-18】。很早以前有小
鼠研究也报道过Gpi1缺陷虽然会导致贫血的症状，但是70%的缺陷小鼠都可以正常存活【19】。所有的这些证据都表明虽然Gpi1是糖酵解通路中的一环， 但是相比于其他的糖酵解酶，它是一种被选择性需要的糖酵解酶（譬如血红细胞和致病性Th17细胞）。这其实正是理想药靶的特点——有效的抑制靶细胞，以及不会对健康细胞产生毒性。
我们随后通过体内体外基因敲除/双敲除，配合metabolic tracing，flux analysis等一系列研究方法，阐明了Gpi1被选择性需要的分子机制。还是用地铁线作比喻，相比于其他的酶，Gpi1在糖酵解通路中的位置非常特殊。它的底物Glucose-6-phosphate可以进入另一条地铁线pentose phosphate pathway （PPP），作为该通路的底物去合成其他物质（譬如NADPH，DNA，RNA）。有意思的是，PPP这条线随后还可以合成Fructose-6-phosphate，或者glyceraldehyde-3-phosphate，从而再回归到糖酵解这条线上，位置正好是Gpi1的下游。我们的实验发现，Gpi1的缺失并没有阻断糖酵解，细胞在这种情况下让葡萄糖分子在PPP这条地铁线上绕了一大圈后继续回到糖酵解通路上来，依然能够为细胞提供生存所需的各种物质（大分子合成前体以及ATP等等）。但是这样绕一圈是有代价的，那就是效率的降低 - Gpi1缺陷Th17细胞从环境中获取葡萄糖的速度降低了一倍左右。理论上讲，在这种情况下，糖酵解涉及到的任何步骤，譬如生物大分子前体的合成速度以及AT
P的生成速度，都会相应的降低，从而对细胞活性产生重大的影响。但是，我们观测到的实际上的变化是细胞将有限的葡萄糖原料主要用于各种生物大分子前体的合成（例如serine，lysine，alanine等等），保证这些分子的合成不受影响。在这种情况下，能用于丙酮酸合成的葡萄糖就大大减少，因为丙酮酸合成的步骤就是糖酵解产生ATP的步骤（一个丙酮酸的产生伴随着一个ATP的生成），因此细胞会大大减少糖酵解过程中ATP的合成量。为了保证细胞不会出现能源危机，细胞又利用了另外一个冗余的通路来补偿ATP的合成，那就是线粒体的有氧呼吸。值得注意的是，线粒体的有氧呼吸也需要利用糖酵解产生的丙酮酸作为底物。如果最终进入了有氧呼吸链，一个丙酮酸分子可以产生12.5个ATP。如果只是进行糖酵解，丙酮酸会变为乳酸而不再生成ATP。Gpi1缺陷的细胞选择将数量很少的原本应该转化为乳酸的丙酮酸转移到线粒体中进行有氧呼吸，从而完全弥补了在这种情况下糖酵解无法合成ATP的问题。所以，通过重新编排PPP和有氧呼吸这两条代谢通路的活性，Gpi1缺陷的细胞可以保证充足的大分子前体和能量分子ATP的合成，从而保证非致病性Th17细胞的正常功能。
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为什么在致病性Th17中Gpi1又是不可或缺的呢？这其实涉及到一个可以大书特书的领域，那就是环境因素对细胞代谢和细胞功能的影响。炎症反应经常伴随着组织低氧【20,21】，
而线粒体的有氧呼吸是依赖于氧气的。这就相当于有氧呼吸这条地铁线在致病性Th17细胞中被天然阻断了。在这种情况下，处于炎症位点的致病性Th17细胞不再能够灵活地编排代谢网络来补偿Gpi1缺陷导致的ATP损失，从而产生了能源危机，导致细胞无法继续介导炎症反应。
至于其他的糖酵解酶，例如Gapdh，由于不存在冗余的通路，对它的抑制会彻底阻断糖酵解，从而导致致病性和非致病性细胞的死亡 （图3简要的概括了本文关于Gpi1的发现）。
图3. Gpi1在不同环境中的选择性冗余提供了特异性抑制致病性Th17细胞的方法。
姚文元墓
结论和展望
我们的研究有着几方面的意义：
1.我们首次报道了可以特异性抑制致病性Th17细胞的方法，并且这种方法有可能不会产生巨大的毒副作用。我们已经开始与药厂合作开发Gpi1特异的抑制剂，希望在不久的将来可以检验其实际疗效以及毒副作用。另外，Gpi1缺失所导致的能量危机其根源在于低氧，因此，许多跟低氧有关的疾病也有可能会被Gpi1抑制剂所改善，譬如风湿性关节炎和肿瘤。
如果药物开发成功的话，许多自身免疫或者肿瘤病患，尤其是对目前方法没有应答，或者目前方法毒副作用太大而无法接受的患者，都可以从这项研究中受益。
2.我们的研究揭示了细胞代谢的网络结构是非常”灵活的”(plastic)，其灵活性来源于众多的冗余元素。尤为重要的是，这些冗余元素可以受到环境因素的影响，从而改变代谢网络的“灵活性”(plasticity)（图2）。这为我们寻特异性的药物靶点创造了很多机会。人类基因组中有代谢功能的基因目前已知的有3000多个，他们分布在376条代谢通路中，而这些通路又相互交错在一起（图1）。在某种特定的细胞中，哪些元件是冗余的，什么因素调控着特定元件的冗余，何种环境分子会影响冗余，冗余在哪个层面影响细胞功能，这些重要问题的答案都很不清楚。考虑到环境因素无穷无尽的多样性（氧浓度，ROS，各种代谢产物和离子的浓度，温度，pH，渗透压，不同组织具有不同的细胞类型，导致不同组织中不同的细胞间信号传递，cytokine，chemokine等等），这些问题会变得更为复杂。我们将来的重点研究方向之一就是在自身免疫病和肿瘤动物模型中去研究这些问题，以期获得新的疾病手段。
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