福建畜牧兽医第43卷第6期2021年
的建立及应用
朱海侠陈雷傅星源潘小慧李枭辰饶云萍
渊兆丰华生物科技渊福州冤有限公司福州350014冤
摘要为更好地了解猪猪肺炎支原体感染或免疫情况袁本研究将猪肺炎支原体168株P97R1基因序列连接至PET-32a载体中进行诱导表达袁经SD S-PA G E和W es t er n Bl ot鉴定后袁获取重组蛋白袁将重组蛋白作为包被用抗原建立检测猪鼻拭子中M hp I gA抗体的间接ELI SA方法遥结果显示袁经诱导表达成功获取大小约35kD a可溶性表达的重组蛋白袁该蛋白能与H i s标签抗体发生特异性结合遥采用重组蛋白作为包被用抗原建立的ELI SA方法优化结果显示院重组蛋白的最佳包被浓度1.0ug/m L袁待检样品最佳稀释比例为1:25袁该方法特异性好尧灵敏度高袁与临床实际情况以及PC R检测结果具有很好的符合度遥结论院采用构建的P97R1重组蛋白包被抗原建立的I gA抗体检测方法具有很好的特异性和灵敏度遥 关键词猪肺炎支原体诱导表达I gA抗体
文献标识码院A文章编号院1003-4331渊2021冤06-0016-05
E st abl i shm ent and appl i cat i on of E L ISA f or M ycopl as m alpneum oni a IgA det ect i on
Zhu H ai xi a Chen Lei Fu X i ngyuan Pan X i aohui LiX i aochen R ao Y unpi ng
渊Jof unhwa Bi ot echnol ogy(Fuzhou)Co.,Lt d.,Fuj i an Fuzhou,350014冤
A bst ract I n oder t o under s t and t he si t uat i on of pi gs i nf ect ed or i m m uni zed wi t h M ycopl asm a hyopneum oni ae.P97R1sequences of M ycopl asm a hyopneum oni ae168st r ai n was l i gat ed i nt o PET-32a vect or t o i nduce expr essi on.A f t er i dent i f i cat i on of t he pr ot ei n by SD S-PA G E and W es t er n Bl ot,i twas used t o est abl i sh i ndi r ectELI SA m et hod f or det ect i on I gA ant i body ofm ycopl asm alpneum oni a i n pi g nas al swab.The r esul t i ndi cat ed t hat t he r ecom bi nant pr ot ei n obt ai ned i n t he st udy was sol ubl e pr ot ei n about35kD a and i t can speci f i cal l y bi nd t o t he l abel ed ant i bodi es of H i s.The m et hod of i ndi r ect ELI SA showed t hat t he opt i m al coat i ng concent r at i on of r e鄄com bi nant pr ot ei n was1.0ug/m L,and t he opt i m al di l ut i on r at i o of t he sam pl e t o be det ect ed was1:25.The m et hod had good speci鄄f i ci t y and hi gh sensi t i vi t y,and had good consi st ency wi t h t he cl i ni cal si t uat i on and PCR r es ul t s.Concl usi on:t he m et hod of i ndi r ect ELI SA est abl i shed i n t he st udy has good s peci f i ci t y
and sensi t i vi t y f or t he det ect i on ofM hp I gA ant i body.
K ey w ords M ycopl asm alhyopneum oni ae I nduced expr ess i on The ant i body ofI gA
猪支原体肺炎渊M ycopl asm al pneum oni a of
swi ne袁M ps冤又称猪气喘病袁是由猪肺炎支原体渊M y鄄
copl as m al hyopneum oni ae袁M hp冤引起的一种慢性呼
吸道疾病遥虽然该病死亡率低袁但发病率高袁世界各
地均有流行[1]遥猪感染该病后会引起机械性咳嗽袁日增重下降袁饲料报酬率降低等遥严重时袁当呼吸道
黏膜纤毛屏障受到破坏后袁很容易继发感染其它病
原菌袁导致猪只死亡遥在当前非洲猪瘟疫情形势严峻
的大环境影响下袁猪价急速上涨袁如何在保证猪不
受非洲猪瘟侵袭的情况下迅速育肥尧出栏袁成为养猪
业密切关注的问题遥
目前对猪支原体肺炎的预防主要有药物和疫苗
预防两种措施遥但在当前国家法规野禁抗冶的背景下袁
疫苗免疫成为防控该病的关键遥研究表明[2]袁疫苗免疫在减轻因该病造成的肺部病变尧提高日增重和饲料转化率方面效果明显袁且对控制同猪只感染尧降低母猪带菌率等非常重要遥当前针对猪支原体肺炎的疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活苗两种袁但灭活苗主要以体液免疫为主袁即使添加相关佐剂的灭活疫苗也只能产生有限的细胞免疫[3]袁猪支原体肺炎灭活疫苗不能阻止野毒的感染遥此外袁对猪肺炎支原体而言袁灭活疫苗诱导产生的抗体水平和阻止病原移行及疾病的发生联系不大袁只能作为一种参考性指标[4]遥猪支原体肺炎灭活疫苗免疫后由于不能阻止猪肺炎支原体野毒对支气管纤毛的定植袁因此袁无法产生完全的保护遥而免疫猪支原体肺炎活疫苗后袁能够有效地激活全身的细胞免疫和局部黏膜免疫[5]遥作为黏膜免疫系统的效应分子袁分泌型I gA在呼吸道尧胃肠道和泌尿生殖道的黏膜抗感染中发挥重要作用[6]遥特异性I gA的水平已经作为大多数研究中评估疫苗使用效果和早期疾病发生的主要依据遥P97蛋白是发现最早的M hp黏附蛋白袁也是最重要的一种毒力因子遥它包含R1和R2两个重复区域袁其中R1区是主要的抗原决定簇[7]遥在M hp感染早期袁血清和黏膜中均能检测到针对P97R1区的特异性抗体袁并已确定为猪肺炎支原体早期感染的血
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福建畜牧兽医第43卷第6期2021年
清学标志物[8]遥抗猪支原体肺炎I gA是M hp感染或免疫后在呼吸道首先产生的特异性标志袁同时也反
映了疫苗免疫后的保护效果[9]遥本研究采用猪肺炎支原体P97R1蛋白作为包被用抗原袁通过建立猪支原体肺炎I gA抗体间接ELI SA检测方法袁结合现有的血清学尧病原学检测方法袁以期更好地用于评估免疫猪M hp疫苗使用效果以及未免疫猪的自然感染情况遥
1材料与方法
1.1菌种尧血清尧阴阳性肺泡灌洗液猪肺炎支原体渊168株冤活疫苗由本公司提供曰PR R SV尧PCV2尧CSFV尧PR V尧TG EV阳性血清由本实验室保存曰M hp 猪阴阳性肺泡灌洗液的制备参照文献[9]遥
1.2主要试剂PET-32a原核表达载体由本实验室保存曰2伊Taq PC R M ast er M i x购自天根生化科技渊北京冤有限公司曰Pr i m eSt ar M ax pol ym er ase尧EcoR 玉尧H i nd芋限制性内切酶尧T4D N A连接酶购自宝生物工程渊大连冤有限公司曰大肠杆菌D H5琢袁t r ans et t a (D E3)购自北京全式金生物技
术有限公司曰质粒提取试剂盒和D N A凝胶回收试剂盒购自M egan曰蛋白凝胶试剂盒购自博士德生物工程有限公司曰H i s融合蛋白纯化柱渊5m L预装柱冤购自上海七海复泰生物技术有限公司曰TM B显液购自上海碧云天生物技术有限公司曰BSA购自Bi oshr ap曰羊抗猪I gA-H R P 购自Bet hl y玉遥
1.3引物设计与合成参照文献[10]袁由上海生工生物技术有限公司合成遥
1.4M hp P97R1基因的扩增以猪肺炎支原体渊168株冤菌株为模板袁用所合成的引物进行P97R1基因扩增遥反应体系院Pr i m eSTA R M ax pr em i x渊2伊冤25uL袁上下游引物渊20um/m L冤各1uL袁D N A1uL袁
补足ddH
2
O至50uL遥PCR反应条件院98益预变性2m i n袁98益变性10s袁58益退火5s袁72益延伸5s袁30个循环曰72益延伸10m i n袁4益保存遥PCR产物用1.0%核酸凝胶电泳检测遥
1.5PET32a-P97R1重组基因表达载体的构建利用D N A凝胶试剂盒对P97R1基因扩增产物进行纯化袁利用ECO R玉和H i d芋限制性内切酶对P97R1基因片段和PE T-32a载体进行双酶切袁利用T4D N A 连接酶对双酶切产物进行连接袁转化袁并对菌落进行鉴定和序列测定袁将鉴定为阳性的菌落进行质粒提
取遥
1.6P97重组蛋白的诱导表达尧纯化及鉴定将重组质粒转化t r anset t a渊D E3冤感受态细胞中袁挑取单菌落袁利用I PTG诱导剂进行诱导表达袁离心收集菌体袁收集的上清和菌体进行SD S-PA G E鉴定袁经
W es t er n Bl ot鉴定正确的菌株经处理后用H i s融合蛋白纯化柱进行纯化遥
1.7猪支原体肺炎I gA抗体间接ELI SA检测方法的建立及应用
1.7.1P97R1蛋白最佳包被浓度及最佳阴阳性肺泡灌洗液稀释浓度的确定采用方阵滴定法袁将P97R1重组蛋白用碳酸盐缓冲液渊CBS袁pH9.6冤按照8ug/m L尧4ug/m L尧2ug/m L尧1ug/m L尧0.8ug/m L尧0.5ug/m L尧0.4ug/m L比例进行稀释后袁包被96孔ELI SA酶标板袁100uL/孔袁同时设置空白对照袁4益包被过夜遥PBST洗涤3次袁拍干袁加入一定量BSA 于37益作用一段时间曰洗涤袁拍干袁将阴阳性肺泡灌洗液按1:10尧1:20尧1:25尧1:30尧1:40尧1:50的稀释倍数进行稀释尧加样袁100uL/孔袁37益孵育一段时间后袁洗涤尧拍干袁加入一定浓度的羊抗猪I gA-H R P袁37益孵育一段时间曰洗涤袁拍干袁加入TM B显袁室温作用10m i n曰加入2M H
2
SO
4
终止反应袁测定O D
450nm 值袁以P/N比值最大的抗原包被浓度和样品稀释度为最佳的工作浓度遥
1.7.2最佳包被条件的确定采用最佳的抗原包被浓度及阴阳性样品稀释倍数袁将酶标板包被抗原后分别置于4益过夜袁37益尧1h袁37益尧2h袁其它条件不变袁以P/N比值最大的包被条件确定为最佳包被条件遥
岳德荣1.7.3最佳封闭浓度及封闭时间的确定采用最佳的抗原包被浓度及阴阳性样品稀释浓度袁将酶标板分别用5%BSA尧4%BSA尧3%BSA尧2%BSA尧1%BSA进行封闭袁其它条件不变袁以P/N比值最大的封闭浓度确定为最佳封闭浓度袁并根据最佳封闭浓度确定最优的封闭时间遥
1.7.4最佳一抗工作时间的确定采用最佳的包被条件袁将阴阳性样品进行一定浓度稀释后袁置37益分别作用30m i n尧45m i n尧60m i n袁其它条件不变袁以P/N比值最大的作用时间确定为最佳一抗工作时间遥
1.7.5羊抗猪I gA-H R P最佳工作条件的确定采用最佳的包被条件袁将羊抗猪I gA-H R P按照一定稀释比例渊说明书推荐浓度冤稀释后分别在37益作用30m i n尧45m i n尧60m i n袁其它条件不变袁以P/N
比值最大的作用时间确定为最佳二抗工作浓度和工作时间遥
1.8临界值的确定用上述建立的方法检测52份
临床鼻拭子样本渊阴性组冤袁测定O D
450nm
值遥根据统
计学原理袁O D
450nm逸X+3SD时袁判定为阳性曰O D450nm
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福建畜牧兽医第43卷第6期2021年臆X+2SD时袁判定为阴性曰介于两者之间的判定为
可疑[11]袁同时利用m edcal c软件分析R O C曲线袁最终
确定其临界值遥
1.9特异性试验按照建立的方法袁分别对
PR R SV尧PCV2尧CSFV尧PR V尧PED V阳性血清样品
进行检测袁根据O D
450nm
值袁确定上述建立方法的特
异性遥
1.10敏感性试验采用上述建立的间接ELI SA方
法对不同稀释倍数的M Ps I gA阳性抗体进行检测袁
确定该检测方法的灵敏度遥
1.11M hp抗体ELI SA检测方法的应用为了解某
猪猪肺炎支原体感染情况袁选取已知试验场采集
猪鼻拭子袁并通过临床疫苗实际免疫情况袁结合
M hp PCR检测方法对猪M ps感染情况进行分析袁
比较该抗体检测方法与猪实际情况的符合率
情况遥
2结果与分析
2.1P97R1基因的扩增以M hp168菌株为模板袁采用特异性引物对P97R1基因进行PCR扩增袁经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测袁结果显示扩增出大小为280bp的目的片段袁与预期结果一致渊见图1冤遥
1院D L2000D N A M ar ker曰2院目的基因
图1P97R1基因的P C R扩增
2.2PET32a-P97R1原核表达载体的构建将PET32a载体与P97R1基因进行连接袁转化后袁利用PET32a通用引物对获取的菌落进行PCR鉴定及测序分析遥结果表明院获取预期结果已知的目的条带
袁测序结果符合预期渊见图2冤遥
2.3重组P97R1蛋白的诱导表达尧鉴定及纯化将重组质粒PET32a-P97R1转化至t r anset t a渊D E3冤中袁挑取单菌落袁经I PTG诱导4h后获得了可溶性表达蛋白袁其大小约为35kD a渊见图3冤遥使用H i s融合蛋白阳性血清作为一抗袁经W est er n Bl ot验证其为H i s 标签融合蛋白遥经H i s标签融合蛋白纯化柱进行纯化袁获取较高纯度的蛋白袁蛋白浓度为336ug/m L遥
M院12-80kda蛋白M ar ker曰1院诱导前样品曰2院诱导后样品曰
3院破碎后沉淀曰4院破碎后上清
图3P97R1重组蛋白诱导表达分析
2.4猪支原体肺炎I gA抗体间接ELI SA反应条件的优化通过方阵滴定试验袁确定其最优反应条件渊见表1冤遥
2.5临界值确定52份M ps阴性猪鼻拭子O D
450nm 的平均值为0.204袁标准差渊SD冤为0.081袁确定院当样
品O D
450nm
值逸0.446判定为阳性曰当样品O D
450nm
值臆0.365判定为阴性曰当0.365<；样品O D450nm<0.446判
定为可疑遥R O C曲线结果显示袁在O D
450nm臆0.365时具有较好的特异性和灵敏度遥
2.6特异性试验结果表明袁本研究建立的间接
M院D L2000D N A M ar ker曰1-3为菌落
图2P97R1
重组基因阳性菌落的鉴定
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表1猪支原体肺炎I gA抗体E LI S A反应条件的优化
新简
摸索条件种类最优反应条件
重组蛋白包被条件
一抗工作条件
最佳封闭条件
最佳羊抗猪I gA-H R P工作条件的确定
TM B显时间
1ug/m L袁37益作用2h
1:20倍稀释袁37益作用45m i n 2%BSA袁37益封闭1h
1:10000倍稀释袁37益作用60m i n
室温作用15m i n
表2猪支原体肺炎I gA抗体E LI S A检测方法特异性检测
阳性样品阴性样品
M ph PR R SV PCV2CSFV PR V PED V M ph
O D
缪蒂生
450nm 判定0.181
代文
阴性
0.109
宝马850rt
阴性
0.132
阴性
0.121
阴性
0.144
阴性
1.233
阳性
0.098
阴性表3猪支原体肺炎I gA抗体E LI S A检测方法灵敏度检测
项目
样品稀释倍数
1:101:201:251:301:351:401:451:50
O D
450nm 判定1.168
阳性
0.764
阳性
0.596
阳性
0.477
阳性
0.47
阳性
0.438
可疑
0.387
可疑
0.363
阴性
ELI SA方法与上述病原均无交叉反应袁具有良好的特异性渊见表2冤遥
2.7敏感性试验应用上述建立的检测方法对不同稀释倍数的M hp阳性肺泡灌洗液进行检测袁结果显示当样品稀释至1:35时袁O D
450nm
值为0.47袁判定为阳性渊见表3冤遥
2.8M hp抗体ELI SA检测方法的应用应用上述建立的方法对某试验场猪的92份鼻拭子样品进行测定袁结果共计检出阴性样品73份袁阳性样品13份袁可疑样品6份遥对阳性样品尧可疑样品及部分阴性样品进行M hp检测袁结果发现袁阳性样品的鼻拭子中均存在M hp抗原袁可疑和阴性样品中无M hp 检出遥
3讨论
黏膜免疫是猪支原体肺炎活疫苗的免疫机制之一遥P97R1是M hp纤毛结合素P97蛋白氨基酸序列C末端的重复序列袁直接参与M hp对猪呼吸道黏膜上皮纤毛粘附并发挥粘附功能袁具有很强的免疫原性[12]遥华利忠等[13]指出袁无论是肺内免疫还是气溶胶免疫猪支原体肺炎活疫苗均能在一定时间内短暂诱导免疫猪上呼吸道的黏膜免疫袁为免疫猪提供早期保护遥SI gA作为黏膜免疫的主要指标袁也是病原体入侵机体后最先产生的抗体遥疫苗免疫后通过快速占位机制能够有效地阻止猪肺炎支原体野毒的入侵遥有报道指出袁支原体仅需1h就能大量粘附宿主细胞袁免疫后2h就能够在肺泡灌洗液中检测到毒株的存在遥本研究发现猪支原体肺炎I gA抗体阳性
猪只鼻拭子中M hp检测基本为阳性袁阴性猪鼻拭子
样品中均未检测到M hp的存在袁且免疫后猪鼻拭子
中M hp存在时间达42d之久遥这一结果再次验证
了猪支原体肺炎活疫苗渊168株冤免疫后能够长时间
在呼吸道黏膜产生很好的占位效应袁且能够刺激机
体产生很好的黏膜免疫反应遥针对猪支原体肺炎抗
体的检测方法袁很多学者做了相关的研究[14]遥逯晓敏等[9]建立了抗猪支原体肺炎I gA间接ELI SA检测方
法袁并将全菌和P97R1蛋白分别作为抗原进行对比
分析袁指出全菌蛋白虽然包含了病原菌的全部抗原
蛋白袁但其可能会与呼吸道其它支原体产生非特应
性交叉反应遥本研究方法与该方法相比大大缩短了
检验时间袁降低了检验过程的复杂性遥
当前市面上存在的猪肺炎支原体试剂盒主要是
针对血清中I gG抗体的诊断试剂盒遥而血清中I gG
抗体水平的高低与动物的免疫保护情况并无相关
性遥且研究表明[5]袁猪免疫猪支原体肺炎活疫苗能够产生细胞免疫袁并不能激活机体体液免疫应答曰自然感染和免疫灭活苗的猪则能够激活机体的体液免疫应答遥本研究发现袁免疫M hp活疫苗的猪血清中无抗体产生袁在鼻拭子中能够检测到I gA的存在袁且经过PCR鉴定有M hp的存在袁随着时间的推移袁猪肺炎支原体含量逐渐降低遥这些结果与先前学者报道的一致[12]遥当前对于猪支原体肺炎抗体的检测并没有一个标准作为参照袁大多依据猪的免疫
渊下转P23冤
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堂堂网情况尧临床症状以及剖检后肺部评分来确定猪感
染猪肺炎支原体的情况遥在当前猪病野老病不断袁旧病新发冶且多种疾病共感染的情况下袁根据上述依据已很难对M hp 疫苗的使用效果作出有效评定遥
本研究通过M hp I gA 抗体检测方法的建立袁结合M hp 抗原检测以及市面上猪支原体肺炎血清抗体检
测袁能够有效区分猪M hp 自然感染或疫苗免疫的情况袁更有利于对猪M hp 免疫情况进行评估袁为猪支原体肺炎疫苗的使用效果提供很好的评估方案遥
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渊上接P19冤
3.3加大企业标准化资金投入加大标准化资金投入袁建立专项管理制度袁包含标准化人才的培养袁加大企业技术尧管理尧工作标准研制袁积极参与国家尧行业尧地方标准制修订遥同时袁也应加大对鸡舍尧饲养设施智能化的投资力度[4]袁不断增强自身在行业内的影响力和可持续发展能力遥3.4建立企业标准数据库平台通过构建规模化蛋鸡养殖场企业标准体系袁建立起一套完整的企业标准数据库袁方便各层级员工查看袁做到标准及时更新袁以达到提高各相关人员的工作效率尧提高各相关管理人员工作水平的目的遥3.5推进标准体系的实施和保持制定标准实施工作计划袁逐步实施标准体系内各项标准袁对实施过程中遇到的各类问题采取有效措施袁保证标准各项要求的贯彻落实遥做好标准实施的记录工作袁及时反馈各环节形成的数据和有关情况遥依据PD CA 管理模式[5-6]袁建立标准实施与监督检查制度袁对标准实施情况进行定期不定时监督和检查袁形成完整的实施检查记录和问题处理记录遥根据标准实施反馈信息袁及时调整和改进标准实施工作袁当发现标准中存
在不完善的问题时袁及时对标准文本进行改进遥4小结
企业标准体系的建立为规模化蛋鸡养殖场进一步完善企业管理提供了工作思路和理论依据袁为进一步提高蛋鸡养殖企业生产效率提供了技术支撑袁为鸡蛋产品质量安全和公共卫生安全提供了保障袁促进福建省蛋鸡养殖行业的健康快速发展遥
参考文献院
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