酶组织化学技术的基本原理及方法
1、金属沉淀反应 ,如硫代胆碱铜法,可证明胆碱酯酶和酯酶;
2、藕联偶氮素法
3、素形成与染法
一 碱性磷酸酶(AKP)
AKP最适宜PH值为9.2-9.4,可被金属阳离子或某些氨基酸激活,多见于活跃的部位,如小动脉、肾小管上皮等。sas macro
⏹AKP黎曼流形染方法:
1、Gomri钙钴法:AKP为黑
注意事项:此法对含铁血黄素和钙盐也可形成棕黑沉淀,必要时应予以鉴别。并且用于透
明的二甲苯为AR级别。
2、Gossrau偶氮吲哚酚法:酶活性部位呈暗褐(坚牢蓝VB)、浅红(坚牢蓝BB)、蓝(坚牢紫B)
二 酸性磷酸酶(ACP)
ACP前列腺活性最强,在肝脏内毛细胆管旁活性最强。
⏹ACP染方法:
1、Berry硝酸铅法:ACP为棕黑,特异性抑制酶是氟化钠。
2、Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法:ACP为红。
三 三磷酸腺苷酶(ATP)
ATP分为三类:膜性ATP、肌球蛋白ATP、线粒体ATP,以上三种酶不可用甲醛固定,用冷冻法。
| 褐变度膜性ATP | 肌球蛋白ATP | 线粒体ATP |
激活剂 | Na+、K+ | Ca+ | Mg+ |
抑制剂 | Ca+ | Mg+ | Ca+ |
PH值 | 7.2-7.5 | 9.0-9.4 | |
存在部位 | 肝脏毛细胆管 近曲小管刷状缘 毛细血管等 | 心肌 其次是骨骼肌 | |
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⏹ATP染方法:
1、Wachstein-Meisel镁激活酶法:ATP为棕黑。
2、Dubowitz-Brooke钙激活酶法:ATP为棕黑。
注意事项:镁激活的ATP正常肝定位于毛细胆管;钙激活ATP区分于红肌纤维和白肌纤维有意义,对于区分神经性肌萎缩和肌源性肌萎缩有价值。
四 胆碱酯酶(CHE)
广义胆碱酯酶分为胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶,胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸,主要分布于血浆、胰腺和唾液腺;乙酰胆碱酯酶主要分布于神经肌肉接头等处。
⏹CHE染法
1、Snell-Garrett胆碱铜法:CHE呈黄或棕黄。
2、Karnovsky-Roots铁氰化铜法:CHE呈红棕或深棕。
二维数组核酸分子杂交技术:具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、芯片杂交(属于固一液相杂交)。
核酸分子杂交技术基本方法:
1、固定:多聚甲醛
2、玻片和组织切片处理:增强组织通透性和核酸探针的穿透性有以下方法,如消化酶、去污剂、TritonX-100。降低背景华都饭店,多聚甲醛固定后浸入和三乙醇胺。240度烘烤片子除去RNA酶
3、杂交:
4、杂交后处理:处理切片用浓度由高到低,但温度是由低到高的盐溶液。
5、显示:
免疫组织化学技术在病理诊断中的应用
细胞凋亡检测技术
组织取材固定及切片技术
组织固定
一 单纯组织固定液
1、甲醛 渗透力强,固定均匀,组织收缩小,但经乙醇脱水后收缩较大。非沉淀性固定剂。
注意事项:甲醛长时间存放容易氧化成蚁酸,蚁酸与组织中的血红蛋白形成甲醛素。
除去甲醛素的方法:Schridde法:75%的乙醇200ml,加浓氨水1ml。切片脱蜡后处理30min;Verocay法:80%乙醇100ml和1%氢氧化钠1ml配置而成,切片脱蜡后处理。
2、重铬酸钾 常用1%-3%作为固定剂。未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀,但可以使蛋白质变为脂溶剂,用于固定高尔基体和线粒体;醋酸化的重铬酸钾可以使蛋白质沉淀,此时染体可以保存,但线粒体破坏。重铬酸钾不能与还原剂混合,其常用于配置混合固定 液,如Zenker液、Helly液、Maximov液、Regaud液。(hmrz液)
3、 易燃易爆,饱和溶液储藏,常用饱和溶液作为固定剂。能沉淀一切蛋白质,穿透慢,组织收缩明显,对脂类无固定作用,可以软化火棉胶和皮肤,固定后放入70%的乙醇或者碳酸锂除去固定时产生的黄。
4、 单纯应用组织收缩明显,常与醋酸和铬盐配置成混合液。可以沉淀蛋白质(白、球蛋白),固定后用5%的碘酒脱汞,再用0.5%的硫代硫酸钠脱碘。
5、醋酸 低于15度为冰醋酸。穿透力强,不能保存糖和脂,固定染体的混合固定液常含有醋酸。缺点是组织膨胀明显。
6、锇酸 强氧化剂不能与还原剂混合(乙醇和甲醛),常用1%-2%作为固定剂。为脂类固定剂,不使蛋白质产生沉淀中药制药。
7、丙酮 沉淀蛋白质,各种酶的固定。
8、三氯醋酸 沉淀蛋白质,是Susa主要成分,也是良好的脱钙剂。
不能使组织蛋白沉淀的单一固定液包括:甲醛、重铬酸钾(非酸化)、醋酸、锇酸(醋甲重锇);对脂类固定无效包括:、铬酸、、醋酸。(苦铬升醋)
二 混合组织固定液
1、B-5固定液 醋酸钠--甲醛固定液,用于固定淋巴组织,若不用甲醛则为B-4固定液。
2、Bouin固定液 外科活检固定液,适用于结缔组织。
3、Carony固定液 DNA、RNA、糖原及尼氏体的固定,不能固定脂肪。固定速度为1h厚度为3mm。
4、Muller固定液 用于媒染和神经硬化组织。
5、Orth固定液 用于固定胚胎组织、神经组织、脂肪组织。黑暗配置、现配现用。
6、PFG固定液 多肽抗原固定,用于免疫电镜。
7、PLP和PLPD固定液 富含糖类组织固定。
8、Zenker固定液 固定肿瘤标本、病毒(Negril包涵体)。不能固定含血量较多的组织,不能接触金属器械。
9、中性甲醛 PH为7,含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
注意事项:Masson染选择甲醛、Zenker液、Bouin液;嗜铬细胞固定选择Zenker液;保存糖原选择Carnoy液。