一、实验目的和内容坡度板
目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；
2. 熟悉凝胶层析的一般过程；
3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；
2. 凝胶柱柱效测定；
3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管 2. 实验材料和试剂
Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）
三、实验步骤
dna甲基化检测方法清洗层析柱
测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积
根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量
称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS
在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出
hargreaves关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液
（重复使用的填料，从此步开始）
边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降
等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积
待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口
通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)
始终保护凝胶上端有一段液体
准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切
沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免
何曙霞
将床面凝胶冲起 （参考完成时间11：30）
打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子 按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次
ufc135加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽
将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比池进液口相连，比池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间16：00）
柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2
其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。
[Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000]
四、注意事项
1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。
4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。
五、演示
（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法
1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。
3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。
4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。
5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位 。
6. 上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。
7. 测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。
记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。
数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A
（二）部分收集器的操作方法：
弗洛伊德
1.将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢"和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。
2.定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。
七、背景资料
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。
凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。
图1 凝胶层析的原理
（一） 层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，
组别分离时，大多采用 20 -30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，其直径在 1 -5cm 范围内，小于 1cm 产生管壁效应，大于 5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 (一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。 ⑴ 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 20－30cm ，柱高与直径的比较 5:1─10:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。 ⑵ 分级分离时柱高与直径之线为 20:1─100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 ⑶ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20 — 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
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