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如何提高团队执行力作者：赵晶，朱建国
来源：《农业开发与装备》 2016年第5期
赵 晶，朱建国
（上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室，上海市 200240）
摘要：猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起猪的一种急性高度接触性传染病，其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白。主要针对PEDV S1蛋白选择九条不同的多肽片段，并利用BALB/C小鼠单克隆抗体制备技术得到识别相应多肽片段的单克隆抗体，针对九条不同多肽表位获得的单克隆抗体与重组原核表达的PEDV S1蛋白识别效果进行对比，最后证实在所选的九条多肽表位片段中，以序列90至102、 621至637、718至731这三条多肽的抗原性最好。 关键词：PEDV S1蛋白；多肽片段表位设计；单克隆抗体制备
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起猪的一种急性高度接
触性传染病，以腹泻、呕吐和脱水为特征，因该病分布广，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。PEDV具有典型的冠状病毒结构，由4种主要结构蛋白组成，分别为磷酸化的核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖基化的纤突蛋白（s）和小囊膜蛋白（E）。其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白，因此，S蛋白对病毒感染、发挥其致病性和决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。利用单克隆抗体制备技术获得高纯度高特异性识别抗原的抗体。利用DNASTAR软件分析并结合NCBI中蛋白数据信息，针对PEDV S1蛋白选取九条多肽序列制备抗体，其氨基酸位置及序列分别为：28至41 STTNFRRFFSKFNV，90至102 GISQEPFDPSGYQ，124至143 FPDNKTLGPTVNDVTTGRNC，151至164 AYMRDGKDIVVGIT，183至193 KNDWSRVATRC，239至252 FATDSNGHIPEGFS，558至569 YGYVSKSQDSNC，621至637 KGELITGTPKPLEGITD，718至731 SNSTFNNTRELPGF。根据实验结果显示：表位抗原90至102，718至731和621至637位氨基酸的单克隆抗体识别效果好。
1 材料和方法
1.1 实验材料
有机氟 BALB/C小鼠购自上海斯莱克动物实验有限公司；抗原多肽片段由GL BIOCHEM公司提供；PEDV S1原核重组表达蛋白由Novo Protein 公司提供；完全弗氏佐剂，非完全弗氏佐剂，HT、HAT、PEG1
500、Ellman试剂均购自SIGMA公司；FBS和IMDM培养基品牌GIBCO；KLH和Protein A/G纯化树脂购自THERMO FISHER；羊抗小鼠二抗品牌Santa Cruz；酶标仪THERMO FISHER 公司型号MK3；二氧化碳培养箱品牌SANYO，型号MCO-18AC。
1.2 实验方法
利用单克隆抗体制备技术进行如下实验。
机电信息
剑麻纤维 1.2.1 完全抗原准备。多肽分别与KLH质量比1：1的偶联，反应条件为4℃ 12h；偶联反应后进行PBS透析，PBS与偶联产物体积比为25：1，透析条件为4℃，每次4h，重复4次。Ellman试剂测定偶联效率及浓度测定。
1.2.2 免疫。第一次免疫，100ug抗原/只，抗原与完全弗氏佐剂等体积混合，总体积为0.3ml，充分乳化后皮下多点注射。第二次至第六次免疫，50ug抗原/只，抗原与非完全弗氏佐剂等体积混合，体积为0.3ml，方法同第一次免疫。通过ELISA方式针对免疫多肽本身进行血清效价检测。加强免疫，50ug抗原/只，抗原与PBS等体积混合，总体积为0.5ml，腹腔注射。
1.2.3 融合。无菌分离小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行PEG1500化学方法进行融合。PEG1500在2min之内加完后立刻用20ml的IMDM培养基进行终止后高速离心10min，弃去上清液加入IMDM+20%FBS+HAT完全培养基均匀混合后铺至96孔细胞培养板置于二氧化碳培养箱内培养。
1.2.4 杂交瘤细胞的选择。利用ELISA方法进行克隆筛选，抗原为原核表达的重组PEDV S1蛋白，包被剂量为125ng/孔，37度孵育2h，2%BSA封闭液，37度孵育1h；加入待检测细胞上清及阴性与阳性对照，阳性对照为融合前血清1：1000稀释，阴性对照为小鼠免疫前血清1：1000稀释，37度孵育1h，二抗37℃孵育1h，显并读数。筛选方法：挑选OD值大于阴性对照OD值5倍的孔作为阳性克隆，挑至24孔培养板中培养一周后，相同方法继续筛选，以此次结果为准确定最终的阳性克隆。
1.2.5 杂交瘤单克隆化。将阳性克隆进行计数并进行有限稀释，培养10天左右利用同上的杂交瘤细胞选择的方法进行筛选，并结合显微镜挑选单克隆细胞至24孔细胞培养板内进行扩大培养同时完成确认筛选，方法同上，单克隆化实验需要进行两次，操作方法及筛选方法一致。
1.2.6 单克隆抗体的生产。选择针对PEDV S1重组蛋白为阳性的克隆进行大规模培养，利用无血清培养收获上清，高速离心以及浓缩获得单克隆抗体。
2 结果
针对每条表位多肽的克隆各挑选两株克隆进行抗体制备，抗体均稀释为1mg/ml，针对PEDV S1重组原核表达蛋白进行ELISA检测数据如表1。
3 讨论
本实验利用单克隆抗体制备技术大大提供了抗体的特异识别功能，并且结合单克隆抗体的特异性识别单表位的功能达到了更好的筛选抗原表位的作用。本实验中选择的9条抗原表位多肽均具有抗原性、亲水性、表面暴露性良好的性质，同时选择一定长度的多肽序列有助于抗原性的增强。选择选用多肽纯度高达98%的多肽最为免疫抗原很大程度上避免由于多肽的纯度不高而带来的部分表位片段造成的免疫体系在免疫剂量上的误差，从而影响到免疫效果。根据九条抗原表位多肽的单克隆抗体制备得到的数据得出：表位氨基酸片段90至102，621至637和718至731具有最好的抗原特性，利用这两段多肽序列可以制备出高效价的兼具高亲和力的抗体，大大节省了后续抗原单表位筛选的时间，也为接下来PEDV 病毒的性抗体和疫苗的研发工作提供了有利的实验依据。
参考文献
影视理论 [1] 冷闯. PEDV S1-1单抗的制备及其葡萄糖诱导酵母表面展示载体的构建[D].江西农业大学，2013.
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