TLR4介导AngⅡ的致炎信号通路及PPARα-γ激动剂的干 TLR4介导AngⅡ的致炎信号通路及PPARα/γ激动剂的干
研究背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)是缺血性心脑血管病的病理基础，目前认为属慢性炎症性或自身免疫性疾病，但发病机制尚未完全清楚。Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)是一类重要的模式识别受体，作为新的炎症信号传递门户蛋白，是免疫反应、慢性炎症和脂代谢紊乱间的桥梁。血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)在As等疾病的发病机制中扮演重要角。Ang II与其受体结合后激活多种信号通路，诱导血管细胞释放多种细胞因子及生长因子，诱发血管炎性反应，导致As发生发展，但Ang II致炎效应与TLR4之间的关系及相关信号通路，国内外尚未见报道。过氧化物酶增殖体激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，与代谢、炎症及As发生等有关。PPARα激动剂非诺贝特和PPARγ激动剂罗格列酮具有抗炎和抗As 作用，但作用机制并不完全清楚，是否与干扰TLR4的信号转导有关尚不十分清楚。研究目的: 1.观察Ang II对血管平滑肌细胞(VSMCs)中TLR4表达及炎性因子产生的影响，探讨Ang II的致炎效应与TLR4信号通路的关系，为阐明As的发病机制提供新的理论依据; 2.研究非诺贝特和罗格列酮对Ang II刺激的VSMCs中TLR4表达及炎性因子产生的影响和分子机制，以期阐明PPARs激动剂新的抗炎和抗As作用机制。研究方法:
1.动物实验利用微渗透泵大鼠皮下埋植方法，在体输注Ang II(150 ng/kg/min)，同时灌胃给非诺贝特(150 mg/kg)和罗格列酮(
5、10 mg/kg)。用放射免疫法测定血清TNF-α和血浆6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)；免疫荧光双标染法检测主动脉平滑肌TLR4和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达;western blot、real-time PCR 法检测主动脉平滑肌TLR
4、MMP-
9、PPARα及PPARγ表达。
2.细胞培养和处理原代培养大鼠VSMCs，以不同浓度Ang
II(10~-9～10~(-6) M)和LPS(50～200 ng/ml)刺激细胞；另一组预先
1 h加入非诺贝特(25～100μM)或罗格列酮(
2.5～10μM)，再用10~(-7) M Ang II刺激
1
2、2
4、3
cd13
6、48 h后，用ELISA法测定细胞上清液中TNF-α和6-keto-PGF1α，细胞免疫荧光染法检测VSMCs中TLR4和MMP-9表达，同法检测VSMCs中TLR
4、MMP-
9、PPARα及PPARγ表达。
3. Ang II刺激VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路研究预先1 h 加入TLR4阻断剂，再用10~(-7) M Ang II刺激细胞24 h，同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-
9、PPARα及PPARγ的表达。预先30 min加入AT1抑制剂losartan、AT2抑制剂PD1233
1
9、ERK1/2抑制剂PD098059或不同的联合，再用10~(-7) M Ang II 刺激细胞24 h，同法检测VSMCs中TLR4表达。预先30 min加入TLR4阻断剂，再用10~(-7) M Ang II刺激细胞24 h，同法检测VSMCs中
IP-10表达。预先1 h加入IP-10阻断剂，再用10~(-7) M Ang II刺激细胞24 h，同法检测VSMCs中PKC表达。预先1 h加入PKC抑制剂白菜屈红碱(CH)，再用10~(-7) M Ang II刺激细胞24 h，同法检测细胞中NF-κBp65表达。
4.小分子干扰RNA(small-interfering RNA, siRNA)培养VSMCs,
按照试剂盒说明用DharmaFECT 2转染试剂将TLR4 siRNA, IP-10 siRNA或negative control siRNA(NC siRNA)瞬时转入VSMCs中。在转染NC siRNA或TLR4 siRNA 48 h后，预先1 h加入非诺贝特(100μM)或罗格列酮(10μM)，用10~(-7) M Ang II刺激细胞24 h，同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-
9、PPARα和PPARγmRNA表达。
5.非诺贝特和罗格列酮对Ang II刺激VSMCs产生炎性因子TLR4信号通路的影响研究预先1 h加入TLR4阻断剂，再给予非诺贝特
(100μM)或罗格列酮(10μM)作用1 h，然后用10~(-7) M Ang II或100 ng/ml LPS刺激细胞24 h，同法测定细胞上清液TNF-α和
6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-
陈鸿鹄
9、PPARα和PPARγ蛋白表达。预先30 min加入losartan、PD1233 1
9、PD098059，再给予非诺贝特(100μM)或罗格列酮(10μM)作用1 h，然后用10~(-7) M Ang II刺激24 h；预先1 h加入非诺贝特(100μM)或罗格列酮(100μM)，再用10~(-7) M Ang II刺激5 min或24 h，同法检测VSMCs中TLR
4、ERK1/2和AT1蛋白表达。细胞在转染NC siRNA或TLR4 siRNA 48 h后，预先1 h加入非诺贝特(100μM)或罗格列酮(100μM)，再用
10~(-7) M Ang II刺激24 h，同法检测VSMCs中IP-10蛋白表达；另一组细胞在转染NC siRNA或IP-10 siRNA 48 h后，预先1 h加入非诺贝特(100μM)或罗格列酮(10μM)，再用10~(-7) M Ang II刺激24 h后，同法检测VSMCs中PKC蛋白表达。预先1 h加入CH，再给予非诺贝特(100μM)或罗格列酮(10μM)作用1 h，然后用10~(-7) M Ang II 或PKC特异性激动剂佛波酯(PMA)刺激24 h，同法检测VSMCs中
NF-κBp65蛋白表达。研究结果:
1. Ang II体内对VSMCs中TLR4和炎性因子产生的影响及
PPARα/γ激动剂的干预结果显示，模型组血清TNF-α升高，血浆
天然气工业杂志6-keto-PGF_(1α)降低(P0.05)；主动脉VSMCs中TLR
4、MMP-9蛋白和mRNA表达增强,PPAR_α、PPAR_γ蛋白和mRNA表达减少(P0.05)。与模型组相比，非诺贝特和罗格列酮降低TNF-α含量，升高6-keto-PGF_(1α)水平(P0.05)，减少VSMCs中TLR
4、MMP-9蛋白和mRNA表达(P0.05)；非诺贝特增加PPARα蛋白和mRNA表达(P0.001)，但对PPARγ蛋白和mRNA表达无明显影响(P0.05)；罗格列酮增加PPARγ蛋白和mRNA表达(P0.001)，但对PPARα蛋白和mRNA表达无明显影响(P0.05)。
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2. Ang II体外对培养VSMCs中TLR4和炎性因子产生的影响及PPARα/_γ激动剂的干预Ang II和LPS刺激VSMCs后,TNF-α剂量和时间依赖性升高,6-keto-PGF1α降低(P0.01)。非诺贝特和罗格列酮剂量依赖性降低TNF-α，升高6-keto-PGF1α( P0.01)。Ang II和LPS刺激VSMCs后,TLR
4、MMP-9蛋白和mRNA表达增加,PPARα、PPARγ蛋白和mRNA表达减少(P0.05)。非诺贝特和罗格列酮均可减少TLR4和MMP-9蛋白及mRNA表达(P0.05)，但非诺贝特仅可增加PPARα蛋白和mRNA表达(P0.001)，罗格列酮仅可增加PPARγ蛋白和mRNA表达(P0.001)。
3. Ang II刺激VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路结果表明，阻断TLR4降低Ang II诱导的VSMCs中TNF-α(P0.05)，升高
6-keto-PGF1α(P0.05)；抑制Ang II诱导的VSMCs中MMP-9蛋白和mRNA表达(P0.05)，增加PPARα及
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PPARγ蛋白和mRNA表达(P0.05)。losartan和PD098059明显抑制Ang II诱导的VSMCs中TLR4蛋白和mRNA表达(P0.05)，而PD123319对此无明显影响，说明Ang II激活TLR4主要由AT1及随后的ERK1/2介导。Ang II增加VSMCs中IP-10蛋白和mRNA表达(P0.01)，阻断TLR4减少Ang II诱导的VSMCs中
IP-10表达(P0.05)，说明IP-10可能位于TLR4致炎信号通路的下游。Ang II明显增加VSMCs中PKC蛋白和mRNA表达(P0.001),IP-10阻断剂减少Ang II诱导的VSMCs中PKC表达(P0.01)，说明Ang II可能通过IP-10激活PKC而发挥致炎作用。Ang II增加VSMCs中NF-κBp65蛋白表达(P0.001),CH减少Ang II诱导的VSMCs中NF-κBp65表达(P0.01)，说明Ang II可能通过PKC而激活NF-κB。
4. PPARα/γ激动剂对Ang II致炎的TLR4信号通路的干预结果显示,Ang II和LPS明显升高VSMCs中TNF-α，降低
6-keto-PGF1α( P0.001);TLR4阻断剂、罗格列酮和非诺贝特均明显减少Ang II和LPS诱导的VSMCs中TNF-α(P0.05)，升高
6-keto-PGF1α(P0.05)；而且罗格列酮和非诺贝特也可增强TLR4阻断剂的效应。TLR4阻断剂、罗格列酮和非诺贝特减少Ang II诱导的VSMCs中MMP-9蛋白表达(P0.05)，但TLR4阻断剂增加PPARα和PPARγ蛋白表达(P0.05)，非诺贝特增加PPARα蛋白表达(P0.05)，罗
格列酮促进PPARγ蛋白表达(P0.05)，三者合用也有协同作用。TLR4 siRNA、非诺贝特和罗格列酮减少Ang II诱导的VSMCs中TNF-α产生(P0.001)，增加6-keto-PGF1α释放(P0.001)，抑制MMP-9 mRNA表达，但TLR4 siRNA几乎完全取消了非诺贝特和罗格列酮的效应。TLR4 siRNA也可取消Ang II减少VSMCs中PPARα和PPARγmRNA表达的效应(P0.05)。在NC siRNA组，非诺贝特或罗格列酮单独上调VSMCs 中PPARα或PPARγmRNA表达(P0.05)，也可促进Ang II诱导的VSMCs 中PPARα或PPARγmRNA表达(P0.05)，但TLR4 siRNA并不改变非诺贝特或罗格列酮促PPARα或PPARγmRNA表达的效应。Losartan、PD09805
9、非诺贝特和罗格列酮均抑制Ang II诱导的VSMCs中TLR4蛋白表达(P0.05)，但非诺贝特与losartan、PD098059合用无协同效应，而罗格列酮对losartan抑制TLR4蛋白表达无加强作用(P0.05)，却可增强PD098059的阻断效应(P0.05)。Ang II增强VSMCs中ERK1/2的磷酸化(P0.001)，罗格列酮明显抑制这一效应(P0.001)，但对未刺激细胞ERK1/2的磷酸化无明显影响。非诺贝特对Ang II刺激或未刺激的细胞ERK1/2磷酸化均无明显影响。Ang II刺激VSMCs后,AT1蛋白表达减少(P0.05)，非诺贝特和罗格列酮对此无影响。TLR4 siRNA、非诺贝特和罗格列酮减少Ang II诱导的VSMCs中IP-10蛋白表达
反渗透(P0.05)，但TLR4 siRNA几乎完全取消非诺贝特和罗格列酮的抑制效应(P0.05)。IP-10 siRNA、非诺贝特及罗格列酮明显抑制Ang II诱导的VSMCs中PKC蛋白表达(P0.05)，但IP-10 siRNA可取消非诺贝
特和罗格列酮的效应(P0.05)。非诺贝特和罗格列酮明显下调Ang II和PMA诱导的VSMCs中NF-κBp65蛋白表达(P0.05)，增强CH的抑制效应(P0.01)。研究结论:
1. Ang II体内外诱发大鼠VSMCs炎症反应及PPARα/γ激动剂的干预1)Ang II促进大鼠VSMCs中TNF-α产生，抑制6-keto-PGF1α
释放。2)Ang II上调大鼠VSMCs中TLR4及MMP-9表达，下调PPARα及PPARγ表达。3)非诺贝特和罗格列酮通过减少Ang II诱导的大鼠VSMCs中TNF-α分泌、促进6-keto-PGF1α释放，调节促炎和抗炎之
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