日本国家标准
JIS Z 2801:2000抗菌制品抗菌性能的检测与评价 引言
本标准是为规范抗菌制品抗菌性能的评价方法制定的，并于1998年12月在“生活相关新型（抗菌）功能制品会议”的报告上公布的，（亦称“抗菌制品的指导方针”）。本标准规定了作为抗菌制品重要性能之一的抗菌性能的测试方法。抗菌制品的其他重要性能，包括安全性、性能持久性以及制品标识则请参考“抗菌制品的指导方针”。
1. 范围
本标准规定了抗菌制品（包括中间制品）表面抗细菌活性及效果的测试方法。
备注：本标准暂不包括抗菌制品的其他功能，如抗真菌性能和除臭性能。
2. 规范性引用标准
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
JIS K 0950 灭菌塑料培养皿
JIS K 0970 微量移液器
JIS K 3800 二级生物安全柜
JIS K 8101 乙醇（99.5）
JIS K 8150 氯化钠
JIS K 8180 盐酸
JIS K 8263 琼脂
JIS K 8576 氢氧化钠
高世宝JIS K 9007 磷酸二氢钾
JIS K 9017 磷酸氢二钾
JIS L 1902 纺织品抗菌性能的检测与评价
JIS R 3505 玻璃量具
3. 定义
本标准中用到的主要术语定义如下：
a）抗菌抑制制品表面细菌生长的状态。
b）抗菌整理为获得抗菌效果而进行的处理。
c）抗菌制品实施抗菌加工后的制品。
d）抗菌活性值抗菌制品和未处理制品在接种细菌培养后，得到活菌数目对数的差值。
参考资料：JIS L 1902的抑菌（静菌）活性和本标准中的抗菌活性概念相同。
e）抗菌效果根据抗菌活性值判定抗菌制品抗菌效果。
4.抗菌效果
按本标准的测试方法，抗菌制品的抗菌活性值应不小于2.0，超过2.0的数值若取得各相关单位同意也可采用。
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5.试验方法
5.1 纺织制品测试方法抗菌纺织制品的检测方法根据JIS L 1902 : 8（定量法）测定
5.2 塑料等制品的测试方法适用于非纺织制品，如塑料制品、金属制品、陶瓷制品等。根据纤维制品的形状和用途也可采用5.1 的方法测试。
5.2.1 试验菌种
试验所采用的菌种见下，需采用下述细菌中的每一种：
a) 金黄葡萄球菌
b) 大肠杆菌
试验所用菌株举例如表1所示。如从有别于表1的机构获取菌株，则该机构必须是国际菌种保藏中心（WFCC: World Federation of Culture Collection）的成员或日本菌种保藏协会（JSCC：Japan Society of Culture Collection）的成员，并且菌株必须和表1相同。
表1 试验所用的菌株
5.2.2 化学试剂、材料和器材
除非另有说明，本试验方法所用的化学试剂、材料和器材如下所示。
乙醇（C2H5OH）符合JIS K 8012规定的一级或更高
牛肉膏微生物试验用
蛋白胨微生物试验用
氯化钠符合JIS K 8150
纯化水符合日本药典第十三次修订版要求
琼脂符合JIS K 8263
酵母浸膏微生物试验用
胰蛋白胨微生物试验用
葡萄糖微生物试验用
酪蛋白胨微生物试验用
大豆蛋白胨微生物试验用
卵磷脂微生物试验用
非离子表面活性剂聚山梨醇脂（吐温80）
磷酸二氢钾符合JIS K 9007
磷酸氢二钾符合JIS K 9017
氢氧化钠符合JIS K 8576
盐酸符合JIS K 8180
棉塞等棉制，或硅胶、金属、莫顿塞等
白金接种环端部直径约为4mm环
干热灭菌器可在160-180℃工作
蒸气消毒锅可保持121℃并在103KMPa保压
安全柜符合JIS K 3800的规定
洁净台微生物试验用
移液管符合或等同于JIS K 0970 或达到JIS R 3505中规定的A级
培养箱温度控制精度±1℃
培养皿玻璃材质，内直径90mm或遵照JIS K 0950中90A或90B规定
洗脱袋微生物试验用
Stomacher 微生物试验用
nc4400
薄膜不影响微生物生长并且不吸水的材料，厚度无明确规定，但要求
附着性好
5.2.3 灭菌方法
a) 干热灭菌放入干热灭菌器在160-180℃下灭菌30-60分钟
注意：灭菌后，如果棉塞或包装纸不小心被水弄湿，相关器皿请不要继续使用。b) 高压蒸汽灭菌在灭菌消毒锅中注入水，将待灭菌的物品装入筐中，并放于消毒锅架子上，盖紧，加热，在121℃或103Kpa下保持15-20分钟。停止加热，然后使其自然冷却到100℃以下，打开排气阀放出蒸汽，打开盖，取出灭菌物品。必要时放入洁净台或安全柜中冷却。为避免灭菌锅受培养物质或化学品污染，用中性洗涤剂洗涤灭菌锅，并用水冲洗干净。
c) 火焰灭菌将待灭菌的物品置于由燃气或酒精燃烧而产生的火焰上，如对于白金接种环应加至红热，对于试管则在火焰上烤2-3秒钟。
d) 器材准备用碱性或中性洗涤剂洗刷试管、烧瓶等器具，充分冲洗，干燥后干热灭菌或蒸汽灭菌后使用。
5.2.4 培养基等
使用下列培养基，如商品培养基和此处介绍的培养基组成相同，则也可使用商品培养基。a）营养肉汤将3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠溶于1000ml蒸馏水或去离子水中，放入锥瓶、混合、充分溶解后，用盐酸或氢氧化钠溶液调节其pH为7.0-7.2（25℃），使用前，将其分别注入试管，加上棉塞，然后进行高压灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。
b）营养琼脂将5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠和15.0g琼脂，加入1000ml蒸馏水或去离子水中，置入锥瓶、混合并放入沸水浴中充分溶解。用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，然后进行高压灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。
c）平板计数琼脂将2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15g琼脂加入到1000ml 蒸馏水或去离子水中，置于锥瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，然后进行高压灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。
人口增长率怎么算d）斜面培养基将6-10ml加热溶解的营养琼脂b)注入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌。
灭菌后的试管在洁净间中以和水平面成15°倾角放置来让其凝固。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。如没有冷凝水出现，将其溶解，并凝固后使用。不要使用配制完存放一个月或以上的斜面培养基。
e）SCDLP肉汤将17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化钠和2.5g磷酸氢二钠、2.5g 葡萄糖和1.0g卵磷脂加入到1000ml蒸馏水或去离子水中，置于烧瓶，加7.0g非离子表
面活性剂以促进溶解。用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2（25℃）.使用此培养基时，将其分散到试管中或烧瓶中，将棉塞塞上，然后用高压湿热法灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的SCDLP肉汤。
波伏娃f）磷酸盐缓冲溶液将34.0g磷酸二氢钾放入容量瓶中，加入500ml蒸馏水或去离子水已将其充分溶解，用氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2(25℃)，然后加入蒸馏水或去离子水将溶液定容到1000ml。使用时，取部分溶液到试管或烧瓶中，塞上棉塞，并加入7.0g 非离子表面活性剂。用盐酸或氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2（25℃）。使用此溶液时，将其分装至试管或烧瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的磷酸盐缓冲溶液。
g）磷酸盐缓冲生理盐水溶液
用浓度为0.85%的氯化钠溶液稀释磷酸盐缓冲溶液至体积比800倍。当使用此溶液时将其分装至试管或烧瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的磷酸盐缓冲生理盐水溶液。
5.2.5 细菌的保藏在无菌条件下转接试验细菌，必要时要使用生物安全柜。一手同时拿着保藏菌和5.2.4 d)的待接种斜面培养基，另一手拿接种环，并用拿接种环的手拔开试管的橡胶塞。在火焰上对试管口灭菌，并对接种环灭菌，然后将接种环的头部放入斜面培养基的冷凝水中冷却。用接种环从细菌生长面上刮下细菌，并用划线法接种到斜面培养基上。用火焰再次对试管口部进行消毒并塞上棉塞。用火焰对接种环进行消毒。在35±1℃下对接种后的斜面进行24-48小时培养，然后在5-10℃保藏。一个月内将其接种到新的斜面（以此类推），但接种次数从菌种中心得到的细菌算起不应超过10代。如保存时间达到或超过一个月，不可进行继代培养。
备注：如图1将接种环端部插入冷凝水中分散细菌，用接种环从底部拉一条线到上部，或将接种环再次插入到冷凝水中画一条折线到顶端。
注意：如细菌保藏机关提供的细菌经过冻干法或冷冻法用于长时间保存，从原始保存菌制备保藏细菌的次数也应包括在细菌培养代数之内。
如使用此保藏菌株，则其继代培养次数不应超过10减去保藏菌的代数。
5.2.6 试验操作细菌操作必须在无菌条件下进行，试验菌注意不能对试验操作人员、设备和环境构成污染，如有需要则使用生物安全柜。
a）细菌前培养用接种环从5.2.5的保藏细菌的培养基中取1环细菌接种到5.2. 4 d)的斜面培养基上，35±1℃条件下培养16-24小时。从这一培养物上，再取一环细菌到新的斜面培养基上，35±1℃条件下培养16-20小时。
b）样片准备从制品上切取边长为50±2mm，厚度不大于10mm[3]的方块，作为标准样片。 空白对照样[4]6块[5]、抗菌样片3块。如不能得到空白对照样，则利用5.2.2的薄膜。密切注意样片和样片制备过程中的微生物污染以及制品的污物污染。最好从制品上采集样片，如由于制品的形状的原因不能从制品采集样片，则利用相同的原料和工艺单独制备样片。
备注：
[3]如难以或不能将制品切成50±2mm，厚度不大于10mm的方块，也可采用非标准形
状和尺寸的样片，这一样片应该可以在其上覆盖400-1600mm2的薄膜。
[4]从空白样或薄膜制得的样片。
[5]6个未抗菌处理样片中，3个用于接种后零时间记数，另外3个用于接种后培养24
小时后记数。
c）样片清洗用纱布或脱脂棉蘸酒精轻轻擦拭b)中样片2-3次，并干燥彻底。若上述处理会导致样片软化、样片表面涂层溶解及组分溶出等现象，则认为此种处理将影响试验结果，可采用其他方法处理或直接试验而不进行任何处理。
d）接种菌液的制备将5.2.4 a）的营养肉汤稀释500倍，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至6.8-7.2，然后高压灭菌，作为1/500NB。将a)中的前培养物取1环均匀分散到少量的1/500NB中，采用显微镜观察法或其它合适的方法估计细菌数目，并用1/500NB稀释菌液至细菌浓度为(2.5～10)×105cfu/ml，以此作为试验用菌液。若菌液不立即使用，将其冷冻至0℃，保存时间不超过4小时。
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e）试验菌液的接种将c)中的样片放入灭菌培养皿中，保持试验面朝上[6]，用移液管[7]准确量取d）中的菌液0.4ml，缓慢滴到每个样片表面。并将薄膜盖于菌液上，调节薄膜使菌液分散到整个薄膜，注意不要使菌液从薄膜边溢出，然后盖上培养皿的上盖。
备注：
[6]试验面必须为制品的抗菌加工面，即使抗菌加工达到制品的一定深度，也不能采用
制品的横切面。
[7]若采用标准尺寸以外的样片，则所加菌液量根据该样片所用薄膜的尺寸按比例减
少。即使对于符合标准尺寸的样片，如按规定量接种时，由于某些材料如陶瓷、玻璃、瓷砖、搪瓷等的亲水性好，难免因培养皿稍微倾斜而导致培养液流出。此种情况下，接种菌液量减为规定菌液量的1/4。但即使菌液量减少也要保证每片上的细菌数为（1.0-4.0）×105cfu/ml，此种情况下，d)中规定的菌液浓度不能满足要求，而必须根据具体要求配制。
[8]薄膜的标准尺寸为40±2mm。若样片为非标准尺寸，则调整薄膜尺寸，以使薄膜边
缘距样片边缘2.5mm以上，但薄膜尺寸不应小于400mm2。在制品由于形状难以将薄膜密着于样片表面，以及由于表面吸水或亲水，不使用薄膜菌液也可在样片表面铺展这二种情况下可不用薄膜。
f）接种后样片的培养将接种后放置3个抗菌样片和3个空白无加工样片的培养皿，在35±1℃相对湿度不小于90%的条件下培养24小时。
参考资料：此时制品的抗菌性能是在该培养温度下的抗菌活性值，但也可同时考虑抗菌材料的使用温度（如室温）下的抗菌性能。
g）培养后样片的洗脱
1）0接触时间的样片的洗脱[9]对3个0接触时间的空白对照样，将覆盖膜和样片用镊子小心放入Stomacher袋以防止菌液损失，用移液管取5.2.4 e)中10ml SCDLP加入到
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