(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110284479.6
国家企业信用公示信息系统(全国)
(22)申请日 2021.03.17
(71)申请人 西湖大学
地址 310024 浙江省杭州市西湖区转塘街
道石龙山街18号
(72)发明人 高亮
(74)专利代理机构 北京金信知识产权代理有限
公司 11225
专利代理师 夏东栋 范继晨
(51)Int.Cl.
G02B 21/16(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本公开涉及一种平铺光片显微镜及样本的
成像方法。该成像方法如下。生成第一波长范围
束；对所述第一激光束进行第一光学调制以及对
所述第二激光束进行第二光学调制。对第一光学
调制后的第一激光束和第二光学调制后的第二
激光束进行组合。将组合后的激光束引导到照明
路径上，并通过扫描激光束产生对应于所述第一
波长范围和所述第二波长范围的第一激发光片
和第二激发光片。在沿着激发光的传播方向对所
述两种激发光片进行平铺，以照亮所述样本。采
集由所述样本发射的荧光。如此，能够对各种样
本组织执行同时至少双成像，而不影响空间分
辨率且不增加图像采集时间。权利要求书2页 说明书7页 附图7页CN 115113384 A 2022.09.27数据库界面设计
C N 115113384
A
1.一种平铺光片显微镜，其特征在于，所述平铺光片显微镜包括：
第一激光器，其构造为生成第一波长范围的第一激光束；
第一空间光调制器(SLM)组件，第一SLM组件配置为对所述第一激光束进行调制；
第二激光器，其构造为生成第二波长范围的第二激光束；
第二空间光调制器(SLM)组件，第二SLM组件配置为对所述第二激光束进行调制；
用字母表示数教学设计组合光学器件，其构造为对利用第一SLM组件调制的第一激光束和利用第二SLM调制的第二激光束进行组合；
振镜，其构造为通过偏转振镜角度将组合后的激光束引导到照明路径上，并通过扫描激光束产生对应于所述第一波长范围和所述第二波长范围的两种激发光片，所述振镜还布置为与所述第一SLM组件和所述第二SLM组件各自的光学调制平面共轭；
激发物镜，其设置在所述照明路径的末端以照亮待检测样本，且其入瞳与所述第一SLM 组件和所述第二SLM组件各自的光学调制平面共轭；以及
检测物镜，其构造为采集由待检测样本发射的荧光。
2.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述第一激光器和所述第二激光器同时开启且持续工作。
3.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述第一SLM组件和所述第二SLM组件被配置为独立工作，以生成两个独立控制且在空间上可分开的激发光片。
浓盐酸
4.根据权利要求1或3所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述第一SLM组件和所述第二SLM组件被配置为通过分别加载相位图来实现对对应于所述第一波长范围和所述第二波长范围的两种激发光片的独立平铺。
5.根据权利要求4所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述两种激发光片的独立平铺使得平铺后的对应于不同波长范围的各个激发光片保持彼此空间分离。
6.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述组合光学器件包括半透半反镜和/或偏振分光器。
7.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述第一波长范围的激光束被用于激发第一波长范围的荧光，所述第二波长范围的激光束被用于激发第二波长范围的荧光。
8.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，还包括分光光学构件，其构造为将由所述检测
物镜采集的不同颜的混合的荧光分离成两种颜范围的荧光。
9.根据权利要求8所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述分光光学构件包括半透半反镜。
10.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述照明路径包括在成像室两侧的对称的第一照明路径和第二照明路径，所述激发物镜包括所述第一照明路径末端的第一激发物镜和所述第二照明路径末端的第二激发物镜。
11.根据权利要求8所述的平铺光片显微镜，其特征在于，还包括：
第一滤光片、第一筒镜和第一检测相机，分离出的第一颜的荧光经所述第一滤光片滤光后利用所述第一筒镜进一步成像到所述第一检测相机；以及
第二滤光片、第二筒镜和第二检测相机，分离出的第二颜的荧光经所述第二滤光片滤光后利用所述第二筒镜进一步成像到所述第二检测相机，所述第一筒镜与所述第二筒镜
具有相同的焦距。
12.根据权利要求11所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述第一SLM组件、所述第二SLM组件、所述第一检测相机和所述第二检测组件以同步方式工作。
13.一种样本的成像方法，其特征在于，所述成像方法包括：
生成第一波长范围的第一激光束；
生成第二波长范围的第二激光束；
对所述第一激光束进行第一光学调制；
对所述第二激光束进行第二光学调制；
对第一光学调制后的第一激光束和第二光学调制后的第二激光束进行组合；
将组合后的激光束引导到照明路径上，并通过扫描激光束产生对应于所述第一波长范围和所述第二波长范围的第一激发光片和第二激发光片；
在沿着激发光的传播方向对所述两种激发光片进行平铺，以照亮所述样本；以及
采集由所述样本发射的荧光。
14.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，所述第一激光束和第二激光束同时启用且持续生成。
15.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，所述第一激发光片和所述第二激发光片分别受独立控制且在空间上分开。
16.根据权利要求13或15所述的成像方法，其特征在于，所述第一激发光片和所述第二激发光片是独立平铺的。
17.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，所述两种激发光片的独立平铺使得平铺后的对应于不同波长范围的各个激发光片保持彼此空间分离。
18.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，对第一光学调制后的第一激光束和第二光学调制后的第二激光束进行组合通过半透半反光学处理和/或偏振分光处理来实现。
19.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，由所述样本发射的荧光包括第一波长范围的荧光和第二波长范围的荧光，第一波长范围的荧光由所述第一波长范围的激光束产生的激发光片来激发，第二波长范围的荧光由所述第二波长范围的激光束产生的激发光片来激发。
20.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，还包括：将采集的不同颜的混合的荧光分离成两种颜范围的荧光。
21.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，所述第一光学调制和所述第二光学调制同步执行。
22.根据权利要求13所述的成像方法，其特征在于，所述样本是经过透明化处理的生物组织，或者是在自然状态下已经透明的生物组织。
平铺光片显微镜及样本的成像方法
技术领域
[0001]本公开涉及一种精密光学仪器及其使用方法，更具体地，涉及一种平铺光片显微镜以及与之相关的样本的成像方法。
生产测井背景技术
[0002]由于生物组织的不透明性，透明化组织的3D荧光成像主要通过对物理切片的组织切片进行成像来完成。组织透明化技术通过使生物组织透明化，使光片显微镜能够用于对生物组织结构进行高速、高空间分辨率三维成像。更重要的是，照明光片的光学切片代替了物理组织切片，使得相关的样品制备，图像采集和图像分析变得更加高效和实用。因此，使用光片显微镜进行组织透明化与3D荧光成像相结合正迅速成为观察大型多细胞生物(如类器官，胚胎，器官乃至整个模型动物)的细胞和亚细胞结构的重要方法。
[0003]多3D荧光成像(尤其是双成像)通常用于确认生物样品中不同细胞器的空间关系。在光片显
微镜下执行双3D成像的常见方法是在每个像平面上依次打开和关闭激发激光器，以不同的激发波长照亮样品。通过双波长通道滤光片对不同颜的发射荧光进行滤光，然后将其聚焦在同一检测相机上。尽管其结构简单，但是由于使用双波长通道滤光片，该方法在两个颜通道之间存在荧光串扰。通过将双通道滤光片替换为由两个单波长通道滤光片组成的滤光轮或二向镜，可以将不同波长的发射荧光分隔，并定向到不同的检测相机或同一检测相机的不同传感器区域，来减少荧光串扰。然而，由于难以同时保持两个波长的激发光片同时对焦并避免荧光干扰，所以双成像仍然用两种配置顺序地执行来完成，这使得图像获取时间加倍，并且两种颜范围看到的图像不是同个时刻的图像。由于对大体积生物组织的单高分辨率三维成像该过程可能持续数小时至数天甚至更长的时间，顺序双成像会将成像时间加倍，因此顺序三维成像对于大型透明组织的高分辨率3D 成像而言会导致更加严重的问题。
[0004]平铺光片显微镜(TLS‑SPIM)已被成功的应用于透明化组织的高分辨率3D成像。TLS‑SPIM通过沿激发光的传播方向在像平面上平移薄的可调激发光片并采集附加图像，在实现更高的空间分辨率和更好的光学切片能力方面优于传统的光学片显微镜。通过使用薄的平铺光片，结合使用最新的组织透明化和组织膨胀技术，生物组织可以以从几微米到几十纳米的各向同性空间分辨率成像。然而，由于需要收集额外的图像，因此光片平铺处理降低了平铺光片显微镜的成像通量。因此，顺序双成像对于TLS‑SPIM是一个更大的问题，因为它使已经被延长的图像采集时间被进一步增加了一倍。提供了本公开以解决背景技术中存在的上述缺陷。
发明内容
[0005]旨在提供一种平铺光片显微镜及样本的成像方法，其能够对各种样本组织执行同时至少双成像，而不影响空间分辨率且不增加图像采集时间。
[0006]在第一方面，本公开的实施例提供了一种平铺光片显微镜。所述平铺光片显微镜
包括第一激光器，其构造为生成第一波长范围的第一激光束。平铺光片显微镜还包括第一空间光调制器(SLM)组件，第一SLM组件配置为对所述第一激光束进行调制。平铺光片显微镜还包括第二激光器，其构造为生成第二波长范围的第二激光束。平铺光片显微镜还包括第二空间光调制器(SLM)组件，第二SLM组件配置为对所述第二激光束进行调制。平铺光片显微镜还包括组合光学器件，其构造为对利用第一SLM组件调制的第一激光束和利用第二SLM调制的第二激光束进行组合。平铺光片显微镜还包括振镜，其构造为通过偏转振镜角度将组合后的激光束引导到照明路径上，并通过扫描激光束产生对应于所述第一波长范围和所述第二波长范围的两种激发光片，所述振镜还布置为与所述第一SLM组件和所述第二SLM 组件各自的光学调制平面共轭。平铺光片显微镜还包括激发物镜，其设置在所述照明路径的末端以照亮待检测样本，且其入瞳与所述第一SLM组件和所述第二SLM组件各自的光学调制平面共轭。平铺光片显微镜还包括检测物镜，其构造为采集由待检测样本发射的荧光。[0007]在第二方面，本公开的实施例提供了一种样本的成像方法。该成像方法包括生成第一波长范围的第一
激光束并生成第二波长范围的第二激光束。该成像方法包括对所述第一激光束进行第一光学调制以及对所述第二激光束进行第二光学调制。该成像方法包括对第一光学调制后的第一激光束和第二光学调制后的第二激光束进行组合。该成像方法包括将组合后的激光束引导到照明路径上，并通过扫描激光束产生对应于所述第一波长范围和所述第二波长范围的第一激发光片和第二激发光片。该成像方法包括在沿着激发光的传播方向对所述两种激发光片进行独立平铺，以照亮所述样本。该成像方法包括采集由所述样本发射的荧光。
[0008]利用根据本公开的各个实施例的平铺光片显微镜及样本的成像方法，其能够对各种样本组织执行同时至少双成像，保持相同的空间分辨率且不增加图像采集时间。
附图说明
[0009]在不一定按比例绘制的附图中，相同的附图标记可以在不同的视图中描述相似的部件。具有字母后缀或不同字母后缀的相同附图标记可以表示相似部件的不同实例。附图大体上通过举例而不是限制的方式示出各种实施例，并且与说明书以及权利要求书一起用于对所公开的实施例进行说明。这样的实施例是例证性的，而并非旨在作为本装置或方法的穷尽或排他实施例。
[0010]图1示出根据本公开实施例的利用平铺光片显微镜的对样本的成像方法的流程图；
[0011]图2(a)示出根据本公开实施例的样本的成像方法的同时双3D成像的原理的示例；
[0012]图2(b)示出根据本公开实施例的样本的成像方法的同时双3D成像的原理的另一示例；
ndm[0013]图3示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜的示意性结构图；
[0014]图4(a)‑图4(h)示出根据本公开实施例的使用染料溶液进行同双成像的平铺光片显微镜的校准的示意图；以及
[0015]图5(a)‑图5(f)示出将根据本公开实施例的同时双成像方法用于涡虫Schmidtea mediterranea的详细结果。
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