山东大学硕士学位论文
只有遵循某些原则，才能有助于它的设计。这些原则是能够确保ＰＣＲ成功的一种包罗万象的规则。
１．引物的特异性：设计的引物与非特异扩增的ＤＮＡ序列的同源性不要超过７０％或者有连续８个互补的同源碱基。 ２．避开产物的二级结构区：引物重复区ＤＮＡ二级结构是引物设计无效的主要原因，因此，选择扩增片段时最好要避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计ｍＲＮＡ的二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（ＡＧｏ）小于５８．６１ｋＪ／ｍｏｌ时，扩增往往不能成功。 ３．长度：寡核苷酸引物长度为１５～３０ｂｐ。
尴尬青春2
４．ＧＣ含量：ＧＣ含量一般为４０％～６０％。Ｔｍ值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，有一半寡核苷酸双链解链的温度，一般高于Ｔｍ值５～１０℃。复性的最佳条件是Ｔｍ值接近７２℃。uc2005
５．碱基随机分布：四种碱基在引物中的分布最好是随机的，切忌有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其３’端不要有超过３个连续的Ｇ或Ｃ，因为这样会使引物在ＧＣ富集序列区引发错误。
６．引物本身：引物本身不应该存在互补序列，否则自身会折叠成发夹状结构使引物本身复性。这种二级结构会产生空间位阻从而影响其与模板的复性结合。
７．引物之间：两引物之间不应有互补性，尤应避免３’端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于４个连续碱基的同源性或互补性。
８．引物的３’端：引物的延伸是从３’端开始的，不能进行任何修饰。
９．引物的５’端：引物的５’端限定着ＰＣＲ产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物５’端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、、Ｅｕ３等；引入蛋白质结合ＤＮＡ序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
１０．密码子的简并性：如扩增编码区域，引物３’端不要终止于密码子的第３位，因密码子的第３位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
木卡姆往事表ｌＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ１ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＰｒｏｔｅｉｎｓＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＥＦ—ＧＦｗ：ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＧＣＡＣＧＣＴＡＣＲｅ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＫｒ］？ＴＡＣＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣＡ久ｎＡＣＧ
ＥＦ—ＧＴｌＦｗ：ＡＴＡＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣＣＡＡＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＲｅ：ＣＧＣＧＴＧＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧ
ＥＦ．ＧＴ２Ｆｗ：ＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＡＡＣＴＧＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＲｅ：ＧＴＡＡＧＡＡＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡ
ＥＦ·－ＧＴ１＋２ＥＦ··ＧＴ１ｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＥＦ－－ＧＴ２ｐｒｉｍｅｒｓ
２．２．２．２目的基因的ＰＣＲ扩增
合成的引物必须与设计好的序列进行对比，确定所合成的序列正确无误。将
引物放在．２０℃保存。从公司合成的引物为粉末状，都粘在ＥＰ管壁上，因此，第
一次使用引物做ＰＣＲ时需要对引物进行处理。将引物从冰箱中取出，１２，０００ｒｐｍ
离心３ｍｉｎ，然后根据引物合成单上的要求，用无菌水将引物浓度稀释到１０ｕＭ。
聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是体外酶促合成特异ＤＮＡ
片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的ＰＣＲ由（１）高温变
性模板；（２）引物与模板退火；（３）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通
过多次循环反应，使目的ＤＮＡ得以迅速扩增。
根据ＧｅｎＢａｎｋ报道的ＥＦ．Ｇ蛋白基因序列ＧｅｎｅｌＤ：９４７８４７，设计如下ＰＣＲ
引物。ＥＦ．Ｇ的正向引物含有ＮｄｅＩ位点，反向引物含有ＸｈｏＩ位点。以Ｅｃｏｌｉ
基因组为模板，ＰＣＲ扩增ＥＦ—Ｇ蛋白基因，然后与ｐＥＴ－２８ａ进行重组，构建重组
质粒，分子量大约为７０００ｂｐ。ＰＣＲ循环参数为：９５。Ｃ５ｍｉｎ；９４。Ｃ变性４０Ｓ， ５５。Ｃ复性４０Ｓ，７２。Ｃ延伸２ｍｉｎ，循环３０次；７２。Ｃ延伸５ｍｉｎ；４＂Ｃ终止反应。以
ＥＦ．Ｇ重组质粒为模板，通过降落ＰＣＲ扩增ＥＦ．Ｇ嵌合体基因。ＰＣＲ循环参数为：
９５＊Ｃ３ｍｉｎ；９４℃变性３０Ｓ，６５℃复性３０Ｓ，７２。Ｃ延伸８ｍｉｎ，循环１５次；９４。Ｃ
变性３０Ｓ，６０℃复性３０Ｓ，７２℃延伸８ｍｉｎ，循环１０次；９４℃变性３０Ｓ，５５℃复
性３０Ｓ，７２℃延伸８ｍｉｎ，循环５次；７２℃延伸１０ｍｉｎ；４＂Ｃ终止反应。ＰＣＲ产
２．２．３重组表达载体的构建
选用带有Ｔ７肩动子的大肠杆菌表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）作为蛋白的表达载体。ｐＥＴ－２８ａ（＋）带有一个Ｎ端Ｈｉｓ—ｔａｇ和Ｃ端的Ｈｉｓ—ｔａｇ。
图２．１ｐＥＴ－２８ａ（＋）的质粒图谱Ｆｉｇ２．ＩｐＥＴ－２８ａ（十）ｖｅｃｔｏｒｍａｐ¨ｒ｛３抽
撕ＩＳ３４
饿１Ｓ”伯嚣｝
图２．２ｐＥＴ－２８ａ（＋）的多克隆位点｜叉：
Ｆｉｇ２．２ＭｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｐＥＴ－２８ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒ
由于选用了舭Ｉ、ＸｈｏＩ位点，并且ＥＦ．Ｇ的反向引物携带终止密码子，所以表达的重组质粒只带有Ｎ端Ｈｉｓ·ｔａｇ。
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ｉＪ东大学硕士学位论文
将胶回收的ＥＦ．ＧＰＣＲ产物和ｐＥＴ－２８ａ（＋）质粒分别进行双酶切，反应体系为５０肛ｌ。
表３双酶切体系
Ｔａｂｌｅ３Ｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ
应力应变曲线组分体积
ｄｄＨ２０
１０×Ｈｂｕｆｆｅｒ
ＮｄｅＩ
ＸｈｏＩ
ＰＣＲ产物／质粒１７ｐｌ５ｇｌ１．５ｇｌ１．５ｇｌ２５¨ｌ
３７。Ｃ过夜酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。回收方法同ＰＣＲ产物的切胶回收。载体酶切产物与目的片段的连接采用ＴＡＫＡＲＡ公司ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ连接体系，按说明书要求操作，使插入片段和载体的摩尔比为３：１至１０：１，１６℃过夜连接。取１０“ｌ连接产物转化１００ｐｌＤＨ５ａ感受态细胞，冰上放置３０ｍｉｎ，热激９０Ｓ，冰上放置３—５ｍｉｎ，加入１ｍｌ的ＬＢ培养基３７。Ｃ，２００ｒｐｍ培养１ｈ，然后１２，０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，将剩下的５０“ｌ菌液重悬均匀的涂在含有卡那霉素
ｈ。
拉尔夫 斯坦曼从转化平板上挑取数个单菌落，在含有卡那霉素的ＬＢ液体培养基中３７℃培养１０＂－－－１６ｈ后参照ＢｉｏｍｉｇａＥＺｇｅｎｅＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ抽提质粒，质粒送上海生工公司测序。
以ＥＦ．Ｇ重组质粒为模板通过ＰＣＲ构建的突变体质粒，由于其突变的目的片段和载体一起被扩增出来，所以扩增产物用参考ＴａＫａＲａＢＫＬＫｉｔ说明书进行平末端连接。平末端连接体系为１０ｐｌ。
表４ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｎａｔｉｏｎ反应体系吴忠将军简历
１ｈｂｌｅ４ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｎａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
组分体积
ＰＣＲ回收产物１０×ＢＫｂｕｆｆｅｒＢＫＥｎｚｙｍｅＭｉｘ８．５ｇｌ１ｇｌ０．５ｇｌ
豫公网安备41160202000603
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