西北农林科技大学 |
基因工程实验报告 |
小麦GAPDH截短体重组与表达 |
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小麦 GAPDH 截短体的重组与表达
(一) 实验思路：
(二) 实验及仪器：
高速冷冻离心机、低温冰箱、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、PCR扩增仪、台式离心、恒温
水浴锅、微量移液器、培养皿、带帽试管、涂布器、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床、1.4ml EP 管、培养皿、电转印、摇床、紫外灯、恒温水浴箱、电泳仪系统、凝胶成像系统等 (三) 实验步骤：
1. 小麦总 RNA 提取（Trizol 法）
1.1 材料：小麦幼苗
1.2 试剂配制及器具处理
1 0.1%的 DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）
2 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小头和 1.5ml 和 0.2ml 的 EP 管等用纱布刀、镊子和药匙等 160℃烘烤 6h 以上。
3 无 RNA 酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶 （180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的 DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 4 Trizol 试剂
5 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和 DEPC 处理过的水配制 75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
6 氯仿（最好用新的）。
7 异丙醇（最好用新的）。
1.3 操作步骤
1.3.1 Trizol 法提取总 RNA
1 先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取 50～100mg 组织粉末加入已盛有 1ml 的 Trizol 液的 EP 管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%），充分混合均匀。
2 室温放置 5min，然后加入 200µL 的氯仿，盖紧 EP 管并剧烈摇荡 15 秒钟。
非营养性吸吮
3 12000rpm 离心 10min，取上层水相于一新的 EP 管中 （千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入 500µN电信L 异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置 10min，12000rpm 离心 10min。
4 小心地弃去上清液，加入 1ml 的 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下 12000rpm 离心 5min。
5 重复步骤④。
6 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥 5~10min （注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度）。用 30µL DEPC 处理过的水将 RNA 溶解，必要时可 55℃～60 ℃水浴10 min。RNA 可进行 mRNA 分离，或贮存于 70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]
1 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上RNA 沉淀在70%，乙醇中可在 4℃保存一周，-20℃保存一年。
2. RT-PCR 扩增目的基因 cDNA
2.1 试剂
1 RNA 模板
2 Olig (dT)18
3 反转录缓冲液羟乙基纤维素
4 dNTP
5 M-MULV 反转录酶
6 RNA 抑制剂（RNasin）
7 Premix EX Taq DNA 聚合酶
8 PCR 特异引物
2.2 操作步骤
2.2.1 RNA 的反转录
采用 Thermo Scientific (Fermentas) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
| 6µL（需加入 RNA 约 1g） |
Total RNA | 1µL |
Oligo dT primer | 5µL |
H2O（nuclease-free） | 12µL |
65℃ 5min，补加下列试剂： | |
5× Reaction buffer | 4µL |
Ribolock RNase Inhibitor | 1µL |
10mM dNTP Mix | 2µL |
RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase | 1µL |
| 20µL |
42℃ 60min | |
70℃，5min，-20℃保存 | |
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2.2.2 PCR 扩增目的基因
2.2.2.1 用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）
2×PCR Mix | 12.5 |
cDNA | 1 |
引物 GAPDH1-1 | 1 |
引物 GAPDH1-2 | 1 |
ddH2O | 9.5 |
total | 25µL |
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PCR程序：
95℃ 1min
95℃ 10s
58℃ 20s 35cycles
72℃ 45s
72℃ 10min
16℃
PCR产物进行电泳并做胶回收
3. 核酸琼脂糖电泳分析
3.1 试剂
1 TAE 缓冲液（50×）：用时需稀释 50 倍
2 点样缓冲液 Loading buffer（10×）：含 0.25%偶氮二异庚腈溴酚蓝和 40%甘油
3 溴乙啶染液(EB)：10mg/ml 溴乙啶，注意 EB 具致癌作用。
4 琼脂糖
3.2 操作步骤
3.2.1 琼脂糖凝胶的制备
称 1g 琼脂糖加入 100ml TAE 缓冲液中加热熔化。
3.2.2 胶板制备
将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入 TAE 缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面 2mm。
3.2.3 点样
每个样品中加入 1/10 体积 Loading buffer（10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。
3.2.4 电泳
接通电源，80V 电压电泳 40min 左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约 2 ㎝处时停止电泳。
3.2.5 观察及照相
将凝胶取出，在 EB 溶液中浸泡 10min 后，用凝胶成像系统照相。
4. pGEX 4T-1质粒的提取
4.1 实验材料
含质粒的大肠杆菌
4.2 试剂
质粒提取试剂盒(天根生物科技)
4.3 操作步骤
4.3.1 培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上，37℃培养 24 h，然后从平板上挑取单菌落，接种于 5 mL 液体培养基中，37℃培养 12 h。
4.3.2 提取步骤
1 柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500µL 的平衡液 BL， 12,000rpm（~13,400×g）离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2 取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（~13,400 ×g）离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
3 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250µL 溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4 向离心管中加入 250µL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。
5 向离心管中加入 350µL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出 现白絮状沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。
6 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将
7 吸附柱 CP3 放入收集管中。
8 向吸附柱 CP3 中加入 600µL 漂洗液 PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。
9 重复操作步骤 7。
10 将吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心 2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
11 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100µL 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000rpm（~13,400×g）离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。
4.3.3 琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA
5. 表达载体和目的片段的酶切
5.1 试剂
1 BamHⅠ
2 SalⅠ
3 BamHⅠ buffer
4 质粒提取试剂盒
5.2 操作步骤
5.2.1 在 LB 液体培养基中接入带 pGEX 4T-1 质粒的菌种，在 37℃下 200rpm 摇菌过夜。参见实验 8 的方法提取质粒。
5.2.2 质粒 DNA 和目的片段的酶切
管号 | 1 | 2 |
pGEX 4T-1 | 32µL | |
PCR 产物 | | 32µL |
ddH2O | 10µL | 10µL |
BamHⅠBuffer（10×） | 5µL | 5µL |
BamHⅠ | 1µL | 1µL |
SalⅠ | 2µL | 2µL |
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6. 载体和外源 DNA 的连接反应
6.1 试剂
1 目标 DNA 片段（PCR 扩增产物）
2 载体（pGEX 4T-1 酶切回收产物）
3 10×ligation 缓冲液
4 T4 DNA 连接酶
5 ddH2O
6.2 操作步骤
取一个 200µL 的 EP 管依次加入下列试剂：
2×buffer： | 5 µL |
pGEX 4T-1 酶切回收产物： | 1 µL |
Pfu扩增并酶切回收的片段： | 3 µL |
T4 连接酶： | 1 µL |
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离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接 3～4h。
7. 感受态细胞的制备及转化（氯化钙法）
7.1 实验材料
大肠杆菌 Top 10 或 BL21（DE3）PlysS
7.2 试剂
① LB 培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录 2）
② 氨苄青霉素 实达网络
7.3 操作步骤
7.3.1 感受态的制备
1 从 LB 平板上挑取单克隆于 5ml LB 培养基中，37℃ 200rpm 摇菌 12～16h。
2 将活化过的菌按 1～5％的体积比接种到新的 LB 液体培养基中，37℃ 200rpm 摇菌约 2h，OD 600 约为 0.4。
3 取 1.5ml 摇好的菌液于一个1.5ml 的 EP 管中，4℃ 4000rpm 离心 3min，弃上清。
4 加 250µL 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃ 6000rpm 离心 1min 弃上清。卢卡斯数列
5 加 200µL 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于 4℃ 存放。12h 内使用效果最佳。
注意：无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。
7.3.2 转化
1 将盛有感受态细胞的 EP 管放置于冰上 10min，加入 10µL 连接产物（若加质粒，则 只需加 1µL），温和混匀，冰浴 20~30min。
2 42℃热激 90S。冰浴 5~10min。
3 加入 800µL LB 液体培养基，37℃培养 45～60min。4000rpm 离心 2min，弃去 800µL 上清液，剩余混匀用来涂板。
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