归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤大鼠肺肾组织caspase-3及caspase-9表达的影响 张朝宁;李金田;刘永琦;蔺兴遥;孙少伯;李娟;李雪燕乌灵参
【摘 要】Objective To explore the influence of Guiqiyiyuan Ointment on the expressions of caspase-3 and caspase-9 in the lung and kidney of the rats damaged by heavy ion (12C6+) radiation-induced bystander effect.Methods The Wistar male rats were equally and randomly divided into seven groups,normal control group (NCG),radiation alone group (RAG) and Chinese medicine group (CMG),with the latter two groups being redivided into 6,12 and 24h groups according to the executing time.The Chinese medicine groups were given Guiqiyiyuan Ointment by gavage for two weeks in advance.The normal control group and the radiation alone groups were given the equal normal saline.Afterwards,the right lung of the rats in the radiation alone groups and Chinese medicine groups were radiated by 2Gy 12C6+ ion once.The rats in normal control group were not radiated.All groups of rats were executed 6,12,and 24h after radiation.The protein and mRNA expressions of caspase-3 and caspase-9 in the right lung,left lung and left kidney were examined with immunohisto
chemistry and Q-PCR.Results Compared with the normal control group,the mRNA expressions of caspase-3 and caspase-9 in the right lung,left lung and left kidney in the radiation alone groups obviously increased 6 and 24h after radiation.While the protein expressions of caspase-3 and caspase-9 in the radiation alone group obviously increased only 24h after radiation (P＜0.01).Compared with the radiation alone groups,the expressions of protein and mRNA ofcaspase-3 and caspase-9 were obviously down-regulated in the Chinese medicine groups (P＜0.01).Conclusion By controlling the up-regulation of the expression ofcaspase-3 and caspase-9,Guiqiyiyuan Ointment can prevent the lung and kidney cell apoptosis and alleviate the damage caused by heavy ion radiation-induced bystander effect in vivo.%目的 探讨归芪益元膏对重离子(12C6+)辐射旁效应损伤大鼠肺肾组织中caspase-3及caspase-9表达的影响.方法 42只雄性Wistar大鼠随机分为7组,即正常对照组(NC组)、单纯辐射组(RO组)、中药组(CM组),后两组按照射后处死时间分为6、12、24h亚组,每组6只.CM组预先用归芪益元膏灌胃2周,NC组和RO组用等量生理盐水灌胃;2周后RO组和CM组大鼠右肺给予2Gy 12C6+离子束单次照射,NC组不照射.于照射后6、12、24h处死各组大鼠,RT-qPCR及免疫组化检测大鼠右肺、左肺、左肾组 织中caspase-3、caspase-9mRNA及蛋白的表达.结果 与NC组比较,RO组大鼠右肺、左肺、左肾caspase-3、caspase-9mRNA表达在照射后6、12、24h均明显升高,而蛋白表达仅在照射后24h明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).CM组大鼠右肺、左肺、左肾caspase-3、caspase-9mRNA及蛋白表达较同时间点的RO组明显下调,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 归芪益元膏可抑制大鼠肺肾组织caspase-3、caspase-9表达的上调,从而减轻重离子辐射诱导的体内旁效应损伤.
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【期刊名称】《解放军医学杂志》
【年(卷),期】2018(043)004
【总页数】5页(P278-282)
【关键词】辐射旁效应;重离子;归芪益元膏
【作 者】张朝宁;李金田;刘永琦;蔺兴遥;孙少伯;李娟;李雪燕
【作者单位】730000兰州 甘肃中医药大学中医临床学院;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌
医学与转化省部共建教育部重点实验室;730000兰州 甘肃中医药大学中医临床学院;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室;730000兰州 甘肃中医药大学中医临床学院;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室;730000兰州 甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室
【正文语种】福州月中华情中 文
张自忠小学
【中图分类】R14
重离子(12C6+)被誉为21世纪最理想的肿瘤放疗用射线，但在临床上用重离子束照射肿瘤部位时，病灶周围未受到直接照射的细胞会接受已照射细胞释放的损伤信号产生辐射旁效应[1]，包括DNA损伤、细胞增殖或凋亡、基因表达改变、表观遗传学改变、炎症反应、致瘤性转化甚至癌症形成等[2-4]。辐射旁效应的防护是辐射生物学和临床癌症领域的重要研究内容。中药因资源丰富、毒副作用小、整体调治、防治结合等优点，目前已成为辐
射防护剂的研究热点[5-7]。归芪益元膏源自《医学心悟》之黄芪汤[8]，加甘肃道地药材当归而成，全方具有益气滋阴、养血活血之效。本实验探讨重离子辐射诱发体内旁效应中caspase-3、caspase-9基因表达的变化以及归芪益元膏的干预作用，以期为重离子辐射旁效应损伤的中医药防护提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及仪器 多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；DAB试剂盒、抗体稀释液、免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗caspase-3多抗(美国ImmunoWay公司)；兔抗caspase-9抗体(美国博奥森生物技术有限公司)；反转录试剂盒、SYBR Fast qPCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；引物设计合成(上海生工生物工程有限公司)。D37520型低温高速离心机(德国Kendro公司)；PRO200型组织匀浆器(美国Bio-Gen公司)；041BR109973型电泳仪、C1000型荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；M-2016型石蜡切片机、TECVEM-J2型石蜡包埋机、VIP-5JR-J2型自动组织脱水机(德国Leica 公司)。
1.2 药品制备 归芪益元膏组成：黄芪30g，当归、熟地、麦冬、人参、枸杞子各15g，五味子10g。方中原药材由甘肃省高校中藏药化学与质量控制实验室提供并进行质量鉴定，鉴
定人为魏舒畅教授。归芪益元膏制备(甘肃中医药大学中药制药实验室)：按处方剂量称取药材，以水作溶剂提取两次，第1次用水量为总药材剂量的8倍，第2次为总药材剂量的6倍，每次提取2h；合并两次提取的药液，300目滤布过滤，滤液减压浓缩后加制剂辅料(防腐剂、增稠剂等)制成膏剂，膏剂浓度为1.64g/ml。
1.3 实验动物及分组 SPF级雄性Wistar大鼠42只，体重200±20g，由甘肃中医药大学S P F级实验动物中心提供并饲养[合格证号SCXK(甘)2015-0002]。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组(NC组)、单纯辐射组(RO组)，中药组(CM组)，后两组按照射后处死时间再分为6、12、24h亚组，每组6只。中药组以归芪益元膏灌胃2周，灌胃剂量按照体表面积折算法，大鼠每日给药剂量约为人临床用量的10倍，即3.28g/(kg.d)，NC组和RO组以等量生理盐水灌胃。
1.4 动物照射 照射前大鼠腹腔注射10%水合氯醛(剂量0.3ml/100g)麻醉。RO组和CM组大鼠右肺给予2Gy 12C6+离子束单次照射，铅皮屏蔽身体其余部位，NC组给予相同方式麻醉，但不照射。重离子照射在中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器研究装置的浅层肿瘤终端上进行，束流为12C6+离子束。坪区照射，能量为165MeV，LET为20keV/μm，吸收剂量率为2Gy/min，用空气电离室监测剂量，照射剂量为2Gy。
svd1.5 标本采集 照射后6、12、24h处死各组大鼠，取出右肺、左肺、左肾，冰生理盐水冲洗，一部分以液氮快速冷却后分别放入无酶冻存管，–80℃冻存；另一部分用4%多聚甲醛固定。nap积分
1.6 RT-qPCR检测肺肾组织caspase-3、caspase-9 mRNA水平 采用Trizol法从肺、肾组织中提取总RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，进行qPCR，引物序列见表1。反应体系：SYBR Fast qPCR Mix(2×)12.5μl，引物2μl，cDNA 2μl，加灭菌蒸馏水至25μl；反应条件：95℃预变性10min，然后95℃ 5s、60℃ 10s，循环40次。以β-actin为内参，用2–ΔΔCt法进行相对定量分析。
表1 各目的基因及内参引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes and reference geneGene name Primer sequences β-actin F:5'-TTGTAACCACCTGGGACTAGATGG-3'R: 5'-AACACAATCTCCACGATAGCAG-3'Caspase-3 F: 5'-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3'R: 5'-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3'Caspase-9 F: 5'-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3'R: 5'-GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA-3'
1.7 免疫组化检测肺肾组织caspase-3、caspase-9蛋白水平 常规石蜡包埋各组大鼠肺肾组织，切片厚度4μm，经脱蜡、水化、修复后，封闭并加抗体孵育，显、脱水、封片后，光学显微镜下读片拍照，用BI-2000免疫组化分析软件计算图片平均灰度值，并进行分析统计(用平均灰度值来表示蛋白相对表达量，灰度值越大，蛋白表达量越低)。
1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 归芪益元膏对大鼠肺肾组织caspase-3、caspase-9 mRNA表达的影响 由表2可见，在右肺组织中，caspase-3、caspase-9 mRNA表达量在单纯辐射6、12、24h后均明显升高，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.01)；CM 12h、24h组caspase-3 mRNA以及6h、24h组caspase-9 mRNA表达量均明显低于同时间点的RO组，差异有统计学意义(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在左肺组织中，单纯辐射6、12、24h后caspase-3、caspase-9 mRNA表达量均明显升高，与NC组比较差异有统计学
意义(P<0.01)；CM 24h组caspase-3 mRNA表达量明显低于RO 24h组，CM 12h和24h组caspase-9 mRNA表达量明显低于同时间点的RO组(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在左肾组织中，caspase-3、caspase-9 mRNA表达量在单纯辐射6、12、24h后均明显升高，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.01)；CM 12h、24h组caspase-3 mRNA表达量明显低于同时间点的RO组，CM 6h、12h和24h组caspase-9 mRNA表达量均明显低于同时间点的RO组(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
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