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锋，郝贵杰，盛鹏程，曹
铮，吴颖蕾，刘
莉
（浙江省淡水水产研究所/农业部淡水健康养殖重点实验室，浙江湖州313001）
ＲT －PCＲ、ＲT －LAMP 采用的抗体和特异性引物均针对罗氏沼虾野田村病毒的衣壳蛋白和编码基因ＲNA 2。采用这3种方法分别检测罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus ，MrNV ），结果表明，免疫胶体金检测试纸能快速检测感染罗氏沼虾野田村病毒的幼虾，但灵敏度较低，能用来检测具有疑似病
症的样品；ＲT －PCＲ和ＲT －LAMP 检测灵敏度都优于免疫胶体金检测试纸，但ＲT －PCＲ方法操作步骤繁琐，所耗时间较长，而ＲT －LAMP 方法操作简便、用时短、不需要特殊仪器，在产物中加入核酸染料后检测结果可用肉眼直接判
定。因此，ＲT －LAMP 方法更适合基层和现场检测，其相关试剂盒的研发更具有应用前景。
关键词：罗氏沼虾野田村病毒；免疫胶体金技术；ＲT －PCＲ；ＲT －LAMP ；检测
中图分类号：S945．4+
19
文献标志码：A 文章编号：1002－1302（2014）10－0214－03
收稿日期：2013－12－19
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201103034）；浙江省湖州市科技项目（编号：2012GN08、
2011ZD2005）；浙江省淡水养殖科技创新团队建设（编号：2012Ｒ10026－11）。作者简介：林锋（1980—），男，硕士，助理研究员，主要从事水产病原微生物研究。E －mail ：wwlinfeng@163．com 。通信作者：刘
莉，副研究员，从事水产动物病害防治研究。
E －mail ：liuli6655@hotmail．com 。
罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii ）是一种生长快、
病害较少、易养殖的淡水养殖虾，目前已经成为我国淡水养殖的主要品种之一，江浙一带是主要产地。罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus ，MrNV ）是危害罗氏沼虾淡化苗的主要病毒，会导致病虾肌肉出现白斑、白浊或全身发
白，通常被称为罗氏沼虾白尾病（white tail disease ，WTD ），严
重时死亡率高达90%以上［1］
课程教育研究，对罗氏沼虾养殖业造成极大的危害，已被列为OIE 申报疫病和我国水生动物二类疫病。
2011年至今，广东、浙江、江苏、上海等地连续几年在罗氏沼
虾幼苗抽检中均检测到该病毒，对该病毒的防控工作还有待加强。目前，罗氏沼虾野田村病毒的检测方法有电镜法、病毒
核酸鉴定法、
ＲT －PCＲ检测法、TAS －ELISA 检测法等［2－6
］，其中，
ＲT －PCＲ是现今最为常用、也是最为经典的检测方法。环介导等温扩增法（loop －mediated isothermal amplication ，LAMP ）是近年发展起来的一种新颖的核酸扩增技术，在恒温条件下高效扩增核酸，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简
便等特点
［7］
，已被广泛用于人、动植物病毒和细菌检测。本
试验在前人研究基础上，结合实际应用需要，采用胶体金免疫层析技术、
ＲT －PCＲ、ＲT －LAMP 3种方法分别检测人工感染MrNV 的罗氏沼虾幼苗和成虾，对3种检测方法的优劣进行比较和分析，以期为罗氏沼虾病毒病的实际诊断提供必要的技术支持。
1材料与方法
1．1
材料
MrNV 病样由浙江省淡水水产研究所实验室人工攻毒制备，
MrNV 单克隆和多克隆抗体自行制备［8］；ＲNA 提取试剂盒（viral ＲNA mini kit ）购自Qiagen 公司；Taq DNA 聚合酶、M －MLV 逆转录试剂盒、DL2000Marker 、100bp DNA Ladder Marker 购自TaKaＲa 公司；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England BIPolabs 公司；AMV 酶、dNTP 购自Promega 公司；甜菜碱、硫酸镁等购自Sigma 公司。1．2引物和探针的设计与合成
ＲT －PCＲ引物采用世界动物卫生组织（OIE ）推荐的MrNV 特异性引物［9］；ＲT －LAMP 反应所用引物和探针根据GenBank 公布的MrNV 编码衣壳蛋白基因ＲNA2序列，由在线软件PrimerExplorer V4（http ：//primerexplorer．jp /e /）设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，从中选出特异性和灵敏度较佳的2对引物，其中包括2条外引物（F3、B3）和2条内引物（FIP 、BIP ）（表1）。引物由上海生工生物公司合成。
—
412—江苏农业科学2014年第42卷第10期
表1
引物序列
检测方法引物名称序列（5'→3'）
克氏锥虫
ＲT －PCＲMrNV －F GCGTTATAGATGGCACAAGG MrNV －ＲAGCTGTGAAACTTCCACTGG ＲT －LAMP
MrNV －F3CGTTAATGCCATCACTGTT MrNV －B3TGGGTACTGCAGGAACAT
MrNV －FIP GCTTAACCAAGATTCTAGACTTGGA －TTTTGCAGTGATTTTCTTACAACTGT MrNV －BIP
CTGCGAGTTCTTTTCTTGGTACCT －TTTCTTGTGCCATCTATAACGCT
1．3MrNV 胶体金诊断方法的建立1．3．1
MrNV 胶体金检测试纸的制备
在实验室自行制备
鼠抗MrNV 单抗和兔抗MrNV 多抗的基础上，与杭州某生物公司合作，以兔抗MrNV 的多抗作为第一抗
体吸附在结合垫
上，再用鼠抗MrNV 单抗与胶体金颗粒标记，制成MrNV 病毒测定胶体金试纸条（图1）
。
1．3．2
MrNV 胶体金检测试纸的应用
称取50mg 罗氏沼虾
幼苗或成虾肌肉组织置于离心管中，加入200μL PBS 缓冲
液，研磨匀浆，5000r /min 离心2min ；用吸管吸取上清液，滴1 3滴到图1所示样品S 孔中，等待2 5min 观察结果。如分别在C （质控线）和T （检测线）处出现沉淀线，表明样品为MrNV 阳性；如仅有C 线出现沉淀线，表明样品为MrNV 阴性；如没有条带出现，表明该胶体金检测试纸条为不合格品。1．4ＲT －PCＲ和ＲT －LAMP 反应1．4．1
病毒ＲNA 的提取称取病毒样本50 100mg ，用
Qiagen 公司的ＲNA 提取试剂盒（viral ＲNA mini kit ）提取样本
病毒ＲNA ，操作步骤参照说明书进行，提取单个样品ＲNA 约10min 。提取的总ＲNA 溶于50μL 双蒸
水中，利用超微量分光光度计（NanoDrop2000，USA ）对核酸浓度进行定量分析。－80ħ保存备用。1．4．2
ＲT －PCＲ反应体系取4μL ＲNA 模板，利用
M －MLV 逆转录试剂盒得到cDNA ，进行PCＲ扩增，反应条件
为：95ħ预变性4min ；94ħ变性40s 、
55ħ退火40s 、72ħ延伸1min ，
30个循环后72ħ15min ；1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。
1．4．3ＲT －LAMP 反应体系1．6mmol /L MrNV －FIP 和MrNV －BIP 、0．2mmol /L MrNV －F3和MrNV －B3、0．05μmol /L MrNV －PＲOBE 、20mmol /L Tris －HCl （pH 值8.0）、10mmol /L 氯化钾、15mmol /L 硫酸铵、8mmol /L 硫酸镁、
0．1%Triton X －100、0．6mol /L 甜菜碱、1．4mmol /L dNTP 、1U 逆转录酶AMV 、8U Bst DNA 聚合酶大片段，终体
积为25μL ；模板4μL 。反应条件为：63ħ反应45min ，
85ħ保温5min 终止反应。反应前，将封存于反应管盖的核酸染料快速振荡，与反应产物混合均匀，静置5min 后，通过颜变化判定结果。2结果与分析
2．1
MrNV 胶体金检测试纸条的制备与应用
将阳性虾组织匀浆液上清进行10－1 10－8
梯度稀释，利用MrNV 胶体金检测试纸条进行检测，结果表明，胶体金检测试纸条仅能检测到10－2
倍稀释度时的样品（图2）。整个检测过程在10min 内可以完成
。
2．2MrNV ＲT －PCＲ检测
将提取的MrNV ＲNA 进行10－1 10－8
梯度稀释，经过ＲT －PCＲ反应，琼脂糖凝胶电泳，结果显示，对于稀释度大于
10－5的样品无法检出（图3）。整个检测过程大概需4 5h
。
2．3
MrNV ＲT －LAMP 检测以10
－1
10－8逐步梯度稀释MrNV ＲNA 为模板，进行环
介导等温扩增，产物同时用琼脂糖凝胶电泳和核酸染料染，结果表明，凝胶电泳1 5号泳道能清楚观察到阶梯状条带，泳道6和泳道7能勉强看到条带（图4）；核酸染料染法检测，1 5号管为绿，7和8号管为橙红，而6号管处于2种颜的过渡阶段，其中，绿为阳性，橙红为阴性（图5）。3
讨论
罗氏沼虾野田村病毒是引起罗氏沼虾幼体产生白体病的
病原，发病高峰期死亡率高达100%。自2004年该病毒从罗氏沼虾白体病样品中被分离出来，其检测方法不断更新发展，
—
赛尔号洛拉斯克
512—江苏农业科学2014年第42卷第10期
从电镜观察发展到分子生物学方法检测，使得罗氏沼虾白体病得到有效控制。但是，近年来，通过在广东、广西、浙江、江苏、上海等地苗场和养殖场抽样调查和采集病样，发现MrNV 有死灰复燃迹象，加强该病的检测与预防显得十分重要。
本试验在实验室原有研究的基础上，选取了目前比较流行的3种病原检测方法对MrNV进行检测比较分析。胶体金检测技术已经被广泛用于医学、动植物病原和食品安全监督等各领域［10］，环介导等温扩增技术自2000年开发以来，已被用于细菌、病毒、寄生虫和胚胎性别鉴定等检测［11－18］。从试验结果可以看出，胶体金试纸条检测法速度快捷、操作方便，但灵敏度相对于PCＲ方法较低；ＲT－PCＲ检测法作为比较经典的检测方法，灵敏度远高于胶体金检测法，但整个操作过程耗时比较长，比较繁琐；ＲT－LAMP检测法相对于胶体金检测法而言，整个过程要长一些，全程大约要45 60min，但灵敏度上有显著优势，是ＲT－PCＲ的100倍左右。3种方法相比较，各有优缺点。
在实际检测过程中，可以根据需要作适当选择，比如，针对已具有肌肉白浊特征的虾样，完全可以用胶体金检测法进行病原诊断；对一些抽检样品，时间和空间上允许的话，可以采用ＲT－PCＲ法；从操作简便、快捷且灵敏度高的角度出发，ＲT－LAMP是三者中最好的选择，特别是近年来ＲT－LAMP 反应产物检测方法的不断发展，由最初的比浊法到现在的比法，减少了琼脂糖电泳的过程，
而且检测结果的灵敏度也近似，这大大节约了时间，降低了成本。因此，相对而言，ＲT－LAMP方法在水生病原检测工作中更具有应用前景，特别是反应产物检测方法的发展，LAMP技术得到进一步完善，更有利于相关检测试剂盒的开发和应用。
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