尹全;李忆;邓强;敬媛
【摘 要】To establish a multiplex PCR method for detecting three kinds of exogenous genes,the T-CaMV 35S,P-CaMV 35S and pat were selected as parameters of multiple PCR detection.The reaction conditions were optimized.The experimental results showed that the optimum annealing temperature of multiple PCR was 56 ℃,the optimum final concentration of primers (μmol/L) ratio was 0.2:0.2:0.2 for T-CaMV 35S:P-CaMV 35S:pat.Using the optimized reaction system to test the sensitivity of multiplex PCR system,the results showed that the sensitivity of the method was 0.5 ng.Using the method of multiple PCR to detect the known samples,the test results showed that the multiplex PCR system was established with good reliability.%为建立一种可同步检测3种外源基因的多重PCR方法,试验选择较常见的T-CaMV 35S,P-CaMV 35S和pat这3个基因作为多重PCR检测对象,对多重PCR体系中引物浓度配比和引物退火温度进行优化.结果表明,多重PCR适宜的引物终浓度(μmol/L)配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat为0.2∶0.2∶0.2以及适宜的引物退火温度为56 ℃;采用优 化后的反应体系对多重PCR体系灵敏度进行测试,结果显示,方法灵敏度为0.5 ng;通过利用建立的多重PCR方法对已知样品进行检测,结果表明,试验建立的多重PCR体系具有良好的可靠性.
【期刊名称】《山西农业科学》
ousia【年(卷),期】2017(045)001
【总页数】5页(P37-40,88)
【关键词】T-CaMV 35S;P-CaMV 35S;pat;多重PCR;检测
【作 者】尹全;李忆;邓强;敬媛
【作者单位】四川省农业科学院分析测试中心,四川成都610066;四川民族学院环境与生命科学系,四川康定626001;四川省农业科学院分析测试中心,四川成都610066;甘孜州农产品质量安全中心,四川康定626000
【正文语种】中 文
【中图分类】Q503
近年来，随着生物技术的不断发展，多种转基因农作物（genetic modified crops，GMC）应用于农业生产，在一定程度上提高了农作物的产量及农产品的质量，有效地缓解了世界人口过多、可耕作土地面积不断减少以及不可预测自然灾害带来的不利影响等。 2015年是转基因作物商业化的第20年，转基因作物种类在持续增加，其种植面积也连续增加了19 a，在2015年有所下降。截至2015年，全球28个国家种植了1.8亿hm2的转基因作物，比2014年28个国家的1.81亿hm2有所减少[1]。种植的转基因农作物主要包括大豆、玉米、棉花和油菜。转基因作物的发展给全球带来了很多收益，据Klumper和 Qaim在2014年全球各地进行的调查试验得到的原始数据，结合过去20 a的147项已知转基因作物研究综合分析表明，转基因作物的出现使化学农药的使用减少了37%、作物产量增加了22%、农民收入增加了68%[2]。但随着转基因技术的不断发展，转基因农产品及加工产品不断增多，人们广泛关注其安全性问题，相关转基因产品标识制度也被越来越多国家制定并实施[3]。而转基因相关检测技术的发展是保证转基因标识制度有效实施的前提条件。
目前，蛋白检测和核酸检测是转基因检测技术的两大类。其中，核酸检测技术中，主要用
sheshefa于农作物及其产品的转基因检测[4-5]的常规PCR技术因其具有快速、敏感、简便的特点而被广泛采用。然而，利用核酸检测技术进行检测时，确认样品中是否含有转基因外源基因成分往往需要对多个外源基因进行筛选检测。尽管常规PCR在转基因检测技术中优势明显，但若是对多个外源基因分别检测时，也存在耗时、繁琐和耗费大等问题[6]。因此，为解决常规PCR技术在检测多个基因时存在的问题，多重PCR应运而生，该技术是将多对特异性引物加入一个PCR反应体系中，针对多个DNA模板扩增多个目的片段[7-8]。由于多重PCR具有操作简便、节省时间、提高效率、降低成本的特点[9-10]，被广泛应用于转基因、病原菌和动物源性等方面的检测[11-13]。
黎明职业大学图书馆多重PCR技术应用于作物外源基因检测中较为普遍，但在前人研究中并没有选择T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat这3种外源基因作为检测组合的多重PCR体系。本研究拟通过对多重PCR检测方法优化，旨在建立包括T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat这3种外源基因的多重PCR筛选检测体系。
沈阳音乐学院刘辉1.1 供试材料及试剂绝路狂飙
试验材料均由四川省农业科学院分析测试中心保存；离心机（5424，德国eppendorf公司）
，PCR仪（Veritee96-well，美国ABI公司），DNA超微量分光光度计（NanoDrop 1000，美国Thermo公司），毛细管电泳仪（QIAxcel Advanced，德国Qiagen公司）；植物基因组提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix购于日本东洋纺绩株式会社；引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
1.2 试验方法
罗迪克发球1.2.1 引物的设计 选择常见的T-CaMV 35S，PCaMV 35S和pat这3个基因作为检测对象，特异性引物序列参照相关国家标准（表1）。
1.2.2 样品DNA提取 样品DNA提取采取试剂盒方法进行[16]。
1.2.3 多重PCR方法的优化建立
1.2.3.1 单基因特异性 在反应总体积为25 μL的PCR体系中进行单基因的扩增。反应体系为：Master Mix（2×）12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板2 μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共运行35个循环；最后72℃延伸3 min。当PCR反应结束后，立即对扩增产物进行结果分析，确定单基因引物是否具有特异
性。
1.2.3.2 多重PCR反应条件的优化 在25 μL反应体系中对退火温度进行优化。Master Mix（2×）12.5μL，3对引物中正反向引物各0.25μL，模板2μL。优化反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火温度设置64，60，58，56，54，50℃6个梯度，退火30 s，72℃延伸30 s，运行35个循环；最后72℃延伸3 min。当PCR反应结束后，立即对扩增产物进行结果分析，确定多重PCR反应程序中最适宜的退火温度。
在25 μL反应体系中对引物浓度进行优化。Master Mix（2×）12.5 μL，引物终浓度配比按照表2设置相应的浓度梯度，DNA模板2 μL。PCR反应程序按照优化后确定的程序进行。当PCR反应结束后，立即对扩增产物进行结果分析，确定多重PCR反应体系中最适宜的引物终浓度配比。
1.2.4 多重PCR检测灵敏度分析 基因组DNA用ddH2O进行梯度稀释，使得反应体系中基因组DNA总质量分别为50，10，3，1，0.5，0.1 ng，使用1.2.3中的反应体系及优化后的反应条件分析多重
PCR方法的灵敏度。
1.2.5 多重PCR检测已知样品 用优化获得的多重PCR检测体系对已知样品进行检测验证。
2.1 样品总DNA提取结果
样品总DNA通过超微量紫外分光光度计测定浓度和质量，经测定得知，所有样品的OD260/OD230值均大于2.0，OD260/OD280值在1.8～2.0，DNA的浓度和质量能满足本试验PCR要求，再将各样品总DNA浓度稀释至25 ng/μL。
2.2 单基因特异性验证结果
从图1可以看出，3对引物均能在相应目标位置处观察到特异性条带，而非特异性条带未见明显扩增。由此可知，本试验选择的引物可用于多重PCR检测体系研究。
2.3 多重PCR体系优化结果
由图2可知，在64℃条件下，T-CaMV 35S基因的目的条带未得到有效扩增，所以，退火温度为64℃不适合；在60℃条件下，T-CaMV 35S基因的目的条带扩增量太小，在150，280，540 bp左右处出现了3条非特异性条带，显然退火温度60℃也不适合；在50，58℃
条件下，所有目的条带都能得到扩增，但是目的条带间的扩增量不一致，所以，这2个温度条件也不适合；而在退火温度为54℃时，各目的条带的扩增量相对一致，但在370，540 bp左右处出现了1条非特异性条带，退火温度54℃也不适合；在56℃时，虽然在540 bp左右处也出现了1条非特异性条带，但并不影响对结果的判断。因此，最终选择多重PCR体系的适宜退火温度为56℃。
引物浓度梯度试验结果如图3所示。从图3可以看出，引物终浓度配比按照方案A，C，D，E，F配比时，目的基因存在扩增效率不一致、无扩增或扩增量小等情况，结果均不太理想；引物终浓度仅按照方案B配比时，各目的基因间的扩增效率相对较高并且相对一致。所以适宜的引物终浓度（μmol/L）配比最终确定为T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat为0.2∶0.2∶0.2。
2.4 多重PCR反应体系灵敏度分析
由图4可知，只有在模板浓度不低于0.5 ng时，3个目标片段才可得到有效扩增。当模板终浓度低至0.5 ng时，所有目的片段均可得到有效扩增，但扩增量相对偏小；在模板浓度低于0.5 ng时，3个外源基因几乎没有扩增。表明建立的多重PCR检测体系灵敏度不低于0.5
ng。
2.5 多重PCR检测已知样品结果
选择已知样品对优化后的多重PCR反应体系进行验证，结果如图5所示。从图5可以看出，所有样品分子特征显示的外源基因与扩增目的条带是对应的。此结果再次验证了多重PCR检测体系的可靠性。
随着科学技术的不断发展，获得的转基因生物越来越多，同时转入的外源基因类型也日益增多，导致转基因产品外源基因成分日渐趋于复杂化。因此，寻求一种快速、简便、经济、准确的检测方法将对转基因相关产品的检测产生有益效果。多重PCR方法被CHAMBERLAIN等[18]于1988年首次提出，截至目前已被广泛应用于检测中的各个领域，包括基因多态性分析、定性定量分析、微生物耐药检测及动物源性检测等[19-20]，多重PCR是科研、检测工作的主要手段，具有很高的实用价值。多重PCR技术只需一个反应和一次电泳即可同时检出多个目的基因片段，可大大节约试剂和时间[21]。李会等[22]对多重PCR法快速检测转基因玉米多种转化体技术优势进行了比较分析研究，结果表明，与单一PCR检测技术相比，成本降低了75%，检测耗时缩短了63%，检测产生的废液减少了75%。
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