细胞与分子生物学铜绿假单胞菌信号分子3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD的 张云燕1，马刘合一2，陈敏怡1，李有强3△，刘润梅4，罗冬元1
摘要：目的制备纯化的人过氧化物酶体增殖物激活受体-配体结合域（PPARγ-LBD）肽段并观察铜绿假单胞菌信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯（3-O-C12-HSL）与PPARγ-LBD的结合强度。方法采用分子对接的方式预测3-O-C12-HSL与PPARγ的结合位点。合成PPARγ-LBD基因序列并插入pET28b质粒，鉴定后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组肽段，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot分析。表面等离子体共振技术检测3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD的结合动力学参数。结果分子对接结果显示3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD区的Tyr473和Tyr327形成氢键，3-O-C12-HSL末端柔性碳链与PPARγ-LBD 区的Met329、Leu330等残基形成疏水结合。制备获得人PPARγ-LBD肽段，经SDS-PAGE及Western blot检测在25~ 35ku有一条蛋白的印迹，与PPARγ-LBD分子质量一致。3-O-C12-HSL与PPARγ结合的亲和力常数为1.65×10-4 mol/L，结合速率常数为1.06×102/ms，解离速率常数为1.75×10-2/s。结论3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD功能区结合能力强于PPARγ特异性拮抗剂GW9662，为制备针对3-O-C12-HSL的特异性靶向药物提供了实验依据。 关键词：铜绿假单胞菌；PPARγ；分子对接模拟；表面等离子体共振技术；N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝
氨酸内酯；配体结合区域
中图分类号：R392.12文献标志码：A DOI：10.11958/20212782
-HSL and PPARγ-LBD in Ligand binding characteristics of signal molecule3-O-C地球破洞
12
pseudomonas aeruginosa
ZHANG Yunyan1,MA Liuheyi2,CHEN Minyi1,LI Youqiang3△,Liu Runmei4,LUO Dongyuan1 1Department of Stomatology,Guangzhou Women and Children's Medical Center,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,China;2School of Medicine,South China University of Technology;3Department of Laboratory Medicine,He Xian
Memorial Hospital,Southern Medical University;4Medical Section,Guangzhou Women and Children's Medical Center,
Guangzhou Medical University
△Corresponding Author E-mail:
Abstract:Objective To prepare purified human peroxisome proliferator-activated receptor-ligand binding domain (PPARγ-LBD)peptide segment and study the binding strength of N-3-oxododecanoyl-l-homoserine lactone(3-O-C12-HSL)to PPARγ-LBD.Methods The binding site of3-O-C12-HSL to PPARγwas predicted by molecular docking. PPARγ-LBD gene was synthesized and inserted into pET28b plasmid.The recombinant peptide fragment was induced by IPTG after identification and analyzed by SDS-PAGE and Western blot assay.The binding kinetic parameters of3-O-C12-HSL and PPARγ-LBD were measured by surface plasmon resonance technique.Results Results of molecular docking showed that3-O-C12-HSL formed hydrogen bond with Tyr473and Tyr327of PPARγ-LBD,and the terminal flexible carbon chain of3-O-C12-HSL formed hydrophobic interaction with the residues of Met329and Leu330of PPARγ-LBD.The human PPARγ-LBD peptide fragment was prepared,and the molecular weight of PPARγ-LBD was25~35ku consistent with that of Western blot assay and SDS-PAGE.The binding affinity constant of3-O-C12-HSL with PPARγwas1.65×10-4 mol/L,the binding rate constant was1.06×102/ms,and the dissociation rate constant was1.75×10-2/s.Conclusion The binding ability of3-O-C12-HSL to PPARγ-LBD functional region is stronger than that of PPARγ-specific antagonist GW9662,which provides experimental basis for preparing specific targeted drugs against3-O-C12-HSL.
化工设备与机械
基金项目：国家自然科学基金青年项目（81801973）；广州市基础研究计划基础与应用基础研究项目（202102080539）
作者单位：1广州医科大学，广州市妇女儿童医疗中心口腔科（邮编510120）；2华南理工大学医学院；3南方医科大学附属何贤纪念医院检验科；4广州医科大学，广州市妇女儿童医疗中心医务部
作者简介：张云燕（1983），女，副主任医师，主要从事口腔科常见病及铜绿假单胞菌的免疫逃逸机制方面研究。E-mail：
△通信作者E-mail：
铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是临床上常见的院内感染条件致病菌。N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯（N-3-oxododecanoyl-L-
homoserine lactone，3-O-C12-HSL）是PA密度感应系统分泌的重要的信号分子之一［1］，可调节免疫细胞的免疫功能，介导免疫逃逸［2-3］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ）是细胞核内受体转录因子超家族成员，由PPARγC末端的配体结合区域（ligand binding domain，LBD）与配体结合后形成二聚体而活化，将各种环境、炎症等刺激转变为胞内信号，调节细胞脂质代谢、分化、免疫等［4］。本课题组前期发现3-O-C12-HSL
可能通过结合PPARγ抑制人单核细胞衍生树突状细胞成熟和功能［5-6］，但3-O-C12-HSL 结合PPARγ的具体特性尚不清楚。为此，本研究采用分子对接和表面等离子体共振技术探讨3-O-C12-HSL与PPARγ的结合及结合强度，为筛选两者结合的抑制剂提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验材料3-O-C12-HSL和对照分子2-氯-5-硝基-N-苯基苯甲酰胺（GW9662）购自Sigma公司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix（-dye）购自TransGen Biotech；PET28b 质粒为本实验室保存；T4DNA Ligase和DH5α感受态细胞购自TransGen Biotech；质粒小提中量试剂盒购自天根生物技术有限公司；OpenSPRTM仪器和芯片购自Nicoya。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、内切酶、纯化柱、His抗体购自普健生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.13-O-C12-HSL与PPARγ分子对接将PPARγ、3-O-C12-HSL和GW9662输入Pubchem数据库（zinc.docking. org/），查询获得三者的成分结构，优化结构并保存为mol格式。从RCSB Protein Data Bank（PDB，/）数据库下载核心靶点的3D结构，保存为PDB格式，使用PyMol 软件删除蛋白结构的水分子和小分子配体，并导入AutoDockTools进行加氢等预处理。对接参数：ga_num_evals= 1200000，ga_pop_size=120，ga_run=12，rmsd=2.0，分子对接采
用软件Autodock4.2。结合能越低，表明结合力越强，结合能≤-5.0kJ/mol的分子与靶点具有较好的结合活性。
1.2.2PPARγ-LBD表达载体的构建通过uniprot（ /uniprot/P37231#sequences）到PPARγ的LBD区（aa238-530），通过NCBI数据库获取目的基因序列，全基因合成获得目的基因的cDNA，用Primer Premier5.0软件添加酶切位点，引物设计及合成引物，C端添加6×His标签，进行目的基因的克隆，见图1。将目的基因和载体酶切、回收、连接，将连接产物转化DH5α细胞，涂板，37℃培养过夜。挑取8个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定成功后挑选2个阳性克隆进行测序。
1.2.3PPARγ-LBD肽段的表达形式分析阳性克隆质粒经转化DH5α细胞、菌种活化及诱导表达后，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证表达情况。从平板上挑取含重组质粒的单菌落，接种于含卡那霉素（50mg/L）的
5mL LB培养基中，37℃过夜培养。取200µL接种于含卡那霉素的20mL LB培养基中，37℃培养至培养液600nm吸光度值为0.6左右。菌液中加入IPTG，于37℃培养4h进行IPTG 诱导的优化。超声裂菌，离心后收集上清液，SDS-PAGE及抗His标签抗体通过Western blot检测大肠杆菌感受态2号菌株和7号菌株中目的肽段。
1.2.4PPARγ-LBD肽段的表达与纯化在2号菌株中加入1mmol/L IPTG，37℃培养4h，培养200mL菌液，离心收集诱导表达后的菌株，加入10mL PBS，超声处理。超声时间2s，间隔2s，功率20kHz，总计30min。离心后收集上清液，Brandford法检测肽段浓度，SDS-PAGE及抗His标签通过Western blot检测目的肽段。
1.2.5表面等离子共振技术（SPR）检测3-O-C12-HSL与人PPARγ结合的动力学特性安装NTA芯片，以150µL/min流速检测缓冲液PBS信号。信号达到基线后，将咪唑和NiCl2溶液注入NTA芯片，将1.00g/L的PPARγ-LBD肽段200µL注入NTA芯片相互作用4min。分别注入300µmol/L的3-O-C12-HSL和GW9662，检测两者与PPARγ-LBD肽段的最大结合力。将流速提高到150µL/min，注入再生缓冲液去除3-O-C12-HSL和GW9662。分别将10、20、40、60、80、160µmol/L的
Key words:Pseudomonas aeruginosa；PPAR gamma;molecular docking simulation;surface plasmon resonance technique;N-3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone；ligand binding
domain
采用大肠杆菌表达质粒pET28b，酶切位点为NdeⅠ/EcoRⅠ，将靶
基因PPARγ-LBD插入多克隆位点（MSC）处形成重组质粒。
Fig.1PPARγ-LBD expression vector
图1PPARγ-LBD表达载体
GW9662和25、50、100、200、300µmol/L的3-O-C12-HSL以20µL/min上样，肽段与配体结合时间240s，自然解离420s，用分析软件TraceDrawer（Ridgeview Instruments ab，Sweden）和1︰1分析方法完成模型分析。
2结果
2.13-O-C12-HSL与PPARγ的对接构象分析3-O-C12-HSL与PPARγ结合能为-10.11kJ/mol，低于对照分子GW9662的-8.29kJ/mol，3-O-C12-HSL较GW9662有更强的结合能力。对照分子GW9662与Tyr327、Tyr473以及Cys285形成氢键，苯环侧链与Leu330形成疏水结合。3-O-C12-HSL与PPARγ的结合与GW9662类似，也与Tyr473和Tyr327形成氢键，其末端柔性碳链与Met329、Leu330等残基形成疏水结合，见图2。
2.2构建PPARγ-LBD表达载体将PET28b-PPARγ-LBD测序序列与NCBI中PPARγ-LBD序列进行比对，显示与PPARγ-LBD区aa238-530的基因序列（870bp）完全一致，见图3。成功构建了PET28b-PPARγ-LBD表达载体。开普敦大学
2.3PPARγ-LBD肽段表达形式分析SDS-PAGE 分析2号和7号菌株中PPARγ-LBD的表达形式，发现PPARγ-LBD肽段在上清液和包涵体均有表达，以包涵体表达为主。Western blot实验发现2号和7号菌株上清液和包涵体中25~35ku均出现预期的蛋白印迹条带，见图4。
A B
A：PPARγ特异性拮抗剂GW9662与PPARγ的分子对接；B：3-O-C12-HSL与PPARγ的分子对接（C-12为3-O-C12-HSL）。
Fig.2Molecular docking analysis of3-O-C12-HSL with PPARγ
图23-O-C12-HSL与PPARγ的分子对接
1102030405060708090
Fig.3Results of positive clone sequencing
图3阳性克隆测序序列的比对结果
10075604535251510
10075604535251510
MW 2µg
MW 2µg
A ：PPARγ-LBD 纯化后SDS-PAGE 鉴定；
B ：PPARγ-LBD 纯化后，
Western blot 检测His 标签的肽段。Fig.5
Analysis of purified PPARγ-LBD protein by SDS-PAGE and Western blot assay
图5
纯化PPARγ-LBD 肽段SDS-PAGE 及Western blot 结果
A B ØMW 1637
1637
NPE
NPE
中学物理教学参考100
756045352515
+
2号菌株7号菌株100
756045352515
Ø
MW 1637
16
37
NPE
DPE
7号菌株100756045352515
Ø
MW 1637
1637
NPE DPE
2号菌株A ：SDS-PAGE 鉴定2号大肠杆菌感受态蛋白；B ：SDS-PAGE 鉴定7
号大肠杆菌感受态蛋白；C ：抗His 标签抗体鉴定2号与7号菌株的Western blot 结果。MW 为分子质
量标记，Ø为非诱导细菌培养（阴性对照），NPE 为上清液，DPE 为包涵体，16和37为诱导时的孵育温度（℃）。
Fig.4
Expression analysis of PPARγ-LBD peptide segment 图4
PPARγ-LBD 肽段的表达形式分析
A B
C
2.4PPARγ-LBD 肽段的表达与纯化纯化2号菌
株上清液中PPARγ-LBD 肽段，纯化后肽段质量浓度为1g/L 。SDS-PAGE 及Western blot 检测抗His 标签的抗体发现在25~35ku 均有一条蛋白的印迹，见图5，与PPARγ-LBD 的分子质量一致。
2.53-O-C 12-HSL 与PPARγ-LBD 的亲和常数3-O-C 12-HSL 与PPARγ-LBD 结合的亲和常数为1.65×10-4mol/L ，结合速率常数为1.06×102/ms ，解离速率常数为1.75×10-2/s 。GW9662与PPARγ-LBD 结合的亲和常数为1.06×10-4mol/L ，结合速率常数为
1.19×102/ms ，解离速率常数为1.27×10-2/s ，见图6。3-O-C 12-HSL 可与PPARγ-LBD 结合，与分子对接结果一致。
3讨论
3-O-C 12-HSL 是PA 体密度感应系统分泌的一种重要的病原体相关分子模式。3-O-C 12-HSL 可调节宿主树突状细胞、巨噬细胞等功能［7］。前期研究发现3-O-C 12-HSL 可通过与PPARγ结合来调节人单核细胞衍生树突状细胞的成熟和功能［5-6］，提示PPARγ可作为PA 感染的靶点，但3-O-C 12-HSL 与PPARγ结合的具体特性尚未明确。
PPARγ是核受体中的一个重要的成员，在细胞
大型纺织厂20120806040反应
a a ：160µmol/L
b ：80µmol/L
c ：40µmol/L
d ：20µmol/L
e ：10µmol/L 0b 时间（s ）
c d e
100100200300400500600700
B -1000
20120806040反应
a a ：300µmol/L
b ：200µmol/L
可比产品成本降低率
c ：100µmol/L
d ：50µmol/L
e ：25µmol/L 0b 时间（s ）
c d e
100100200300400500600700
A A ：3-O-C 12-HSL 与PPARγ-LBD 肽段结合；
B ：GW9662与PPARγ-LBD 肽段结合。
Fig.6Dynamic binding curves of PPARγ-LBD with 3-O-C 12-HSL,
GW9662
图6
PPARγ-LBD 与3-O-C 12-HSL 、GW9662浓度梯度结合曲线
免疫、脂质代谢等方面具有重要功能。PPARγ-LBD 是PPARγ的一个重要激活区域，该区域由12个α螺旋结构域组成，LBD通过与配体结合来诱导转录激活［8-9］。LBD被组装在一个三层反向平行的螺旋形“三明治”里，构成疏水腔，称为配体结合袋。PPARγ的配体结合袋较大，允许结合不同大小的配体。3-
O-C12-HSL分子式为C16H27NO4，相对分子质量297.39。本研究用生物信息学预测3-O-C12-HSL与
PPARγ的分子对接位点，发现3-O-C12-HSL疏水的尾巴深入到PPARγ的配体结合袋中，与Tyr473和Tyr327形成氢键，末端柔性碳链与Met329、Leu330等残基形成疏水结合。氢键的形成增强了3-O-C12-HSL与PPARγ的结合能力，能更好地激活PPARγ。
SPR是一项利用生物传感芯片进行分析的技术，该技术将分析样品固定在SPR传感器上，利用光学测量的折射率变化来检测分子的结合情况。SPR 可以实时并快速对蛋白、小分子等进行定性和定量分析，可以连续监测吸附和解离过程，进行成分间相互作用的研究［10］。本实验使用SPR实时监测了3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD的结合和解离的过程，测得两者结合的亲和力常数为1.65×10-4mol/L，结合速率常数为1.06×102/ms，解离速率常数为1.75×10-2/s，显示两者具有较好的亲和力，与分子对接的结果一致。
综上所述，本研究成功制备获得了PPARγ-LBD 肽段，应用SPR证实3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD 结合能力强，进而发挥免疫调节功能，为临床预防和PA感染提供了实验依据。下一步本课题组拟筛选3-O-C12-HSL与PPARγ-LBD结合抑制剂，阻断两者结合，以指导PA感染的预防和用药。
志谢
感谢广州市妇女儿童医疗中心儿研所刘明博士给予对接构象分析实验的指导。
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（2022-01-04收稿2022-02-28修回）
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