Research Report
蔡元适1甘嘉嘉1蓝海琳1贺庆华1张庆莲2*
1西南民族大学生命科学与技术学院，青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室，成都,610041;2成都医学院，检验医学院，成都,610500*通信作者,*****************
摘要3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐藻(Dunaliella salina )甘油合成途径上的关键酶，本研究首次报道了一
条胞质型GPDH 基因的克隆(命名为DsGPDH1)，经大肠杆菌表达和融合蛋白的纯化及性质鉴定，也研究了在盐胁迫期间DsGPDH1和DsGPDH2的表达变化。研究发现DsGPDH1和DsGPDH2相比，少了一段信号肽序列，但包含完整的SerB 结构域和GPDH 结构域。通过大肠杆菌制备的融合DsGPDH1蛋白高度可溶，但却没有NADH 依赖的脱氢酶活性，其SerB 结构域是否具有磷酸化酶的活性还没有研究清楚。在高盐胁迫时DsGPDH1和DsGPDH2都表现出诱导性高表达，在低盐胁迫时，DsGPDH1的表达被高度抑制，但DsGPDH2的表达变化却不太明显。GPDH 同工酶在盐藻甘油合成中的具体分工 仍然不清楚，但本研究迈出了坚实的一步。
关键词
盐藻,GPDH，甘油，耐盐
Cloning and Characterization of a Cytoplasmic Glycerol 3-phosphate Dehydrogenase Gene from Dunaliella salina
Cai Yuanshi 1Gan Jiajia 1Lan Hailin 1He Qinghua 1Zhang Qinglian 2*
1College of Life Sciences and Technology,Southwest Minzu University,Chengdu,610041;2Department of Laboratory Medicine,Chengdu Medical College,Chengdu,610500
*Corresponding author,*****************DOI:10.13417/j.gab.039.004122
Abstract Glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH)is the key enzyme on the glycerol synthesis pathway of
Dunaliella salina .This paper reports for the first time the li expression,recombinant protein purification and characterization of a cytoplasmic GPDH isoform (named DsGPDH1),the expression profile of DsGPDH1is also investigated under salt stress and compared to that of DsGPDH2.The results show that DsGPDH1lacks a signal peptide compare to DsGPDH2,but contains the entire SerB domain and the entire GPD domain.The fusion DsGPDH1protein prepared by Escherichia coli is highly soluble but does not have NADH-dependent dehydrogenase activity,and whether the phosphoenzyme activity in the SerB structure domain has not been studied.Under high salt stress,DsGPDH1and DsGPDH2show high induced expression;under low salt stress,DsGPDH1expression is highly inhibited,but the change of DsGPDH2is not obvious.The specific division of labor of GPDH isozymes in glycerol synthesis of salina is still unclear,but this study is a solid step forward.Keywords
Dunaliella salina ,GPDH,Glycerol,Salt tolerance
基金项目：本研究由西南民族大学中央高校项目(2020PTJS15)和国家级大创项目(201810656095)共同资助
引用格式：Cai Y.S.,Gan J.J.,Lan H.L.,He Q.H.,and Zhang Q.L.,2020,Cloning and characterization of 中国在疫情防控国际合作上采取了哪些行动
a cytoplasmic glycerol 3-phosphate dehydrogenase gene from Dunaliella salina ,Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology),39(9):4122-4129(蔡元适，甘嘉嘉，蓝海琳，贺庆华，张庆莲,2020，盐藻胞质型3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆及性质鉴定，基因组学与应用生物学,39(9):4122-4129)
杜氏盐藻(Dunaliella salina )是一种极耐盐的单
细胞真核绿藻，能生存于含0.05mol/L 至饱和NaCl
(~5.5mol/L)的溶液中(Ben-Amotz and Avron,1973)。现已证明，杜氏盐藻具有超强渗透调节的功能，主要
烟酒伴侣
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第9期，第4122-4129页
是通过在细胞内快速合成大量的兼性溶质甘油来平衡细胞外的渗透压。报道称，当把盐藻细胞转移到高盐溶液时，其能在2~3h合成所需甘油并平衡细胞外的渗透压(Ben-Amotz and Avron,1973;Chitlaru and Pick., 1991)。且生长于含4mol/L NaCl的溶液的盐藻细胞甘油含量高达约8mol/L(Chitlaru and Pick,1989;Oren, 2005;2017)。这一特点使许多研究人员感兴趣，并把杜氏盐藻(Dunliella salina)作为研究渗透和盐胁迫的模式物种(Liska et al.,2004;Oren,2005)。
对于盐藻的甘油合成，研究者提出了和酵母相似的甘油合成途径，即磷酸二羟基丙酮(DHAP，来自糖酵解途径)，被3-磷酸甘油脱氢酶催化，生成3-磷酸甘油(G3P)，G3P再被3-磷酸甘油磷酸化酶催化，生成甘油，(Ben-Amotz and Avron,1974;Goyal,2007)。在该途径中，GPDH被认为是一个关键的限速酶(Gee et al.,1989;Gee et al.,1993)。对天然盐藻GPDH的纯化和特性研究，显示出了该酶与高等植物GPDH的不同之处，比如，分子量较大，去垢剂对其活性没有影响，却抑制高等植物GPDH的活性(Gee et al.,1993; Ghoshal et al.,2002)。
研究同时指出，杜氏藻中有三种GPDH同工酶，其中有两种位于叶绿体中，第三种则位于细胞质中。并按功能命名为：(1)叶绿体渗透调节型，在甘油合成中发挥作用；(2)叶绿体甘油型，在脂质合成中起作用；(3)胞质甘油酯型，也在脂质合成中起作用(Gee et al.,1993;Ghoshal et al.,2002)。这些文章很好地奠定了盐藻GPDH研究的基础，但由于得到的是部分纯化的天然GPDH，所以也存在很大的局限性。2007年，贺庆华等首次报道了盐藻GPDH的核酸序列，该序列揭示了盐藻GPDH独特的双结构域，除C端经典的NADH依赖的3-磷酸甘油脱氢酶结构域外，在N端还有一个SerB(Phosphoserine phosphatase，磷酸丝氨酸磷酸化酶)结构域。据此，有学者提出SerB结构域可能发挥3-磷酸甘油磷酸化酶的作用，如此，盐藻GPDH可以直接催化DHAP生成甘油，有利用甘油的快速合成(He et al.,2007)。后来陆续有几篇文章报道了衣藻和杜氏藻的其它几个种的GPDH，这些GPDH都具有类似的双结构域(He et al.,2009;Her-rera-Valencia et al.,2012)。
Morales-Sánchez等(2017)采用无细胞体外蛋白质合成系统，合成了衣藻的GPDH2(CrGPDH2)，并报道CrGPDH2能够直接催化DHAP生成甘油，然而由于其所用的甘油检测试剂盒不太适合检测该酶反应液，所以其结论不是很坚实。
本研究报道了盐藻细胞质型GPDH(DsGPDH1)
的克隆和大肠杆菌表达，并成功地表达出了可溶性的DsGPDH1，纯化得到了大量的DsGPDH1，初步进行了酶活性分析。该研究为后续通过结构生物学的方法研究盐藻GPDH提供理论基础。此外，本研究采用Real-time PCR的方法观察了在盐胁迫时DsG-PDH1和DsGPDH2的表达变化，这些数据有利于本研究弄清不同盐藻GPDH同工酶的分工。
1结果与分析
1.1DsGPDH1的克隆
RT-PCR成功克隆并通过测序验证了从转录组里到的DsGPDH1的EST。根据EST序列，利用3'和5'RACE克隆DsGPDH1cDNA的3'和5'区，最后分别扩增出一个1.7kb片段和一个1.1kb片段。序列分析表明，1.7kb片段包含DsGPDH1的整个3'端(包括3'UTR和Poly A)，而1.1kb片段并没有包含ORF的完整5'端，缺失了部分ORF和整个5'UTR。由于5'RACE无法进一步往5'端推进，所以本研究采用染体
步移法对DsGPDH1的5'端进行扩增，通过染体步移克隆得到了大小为734bp的片段。该片段包含预测的启动子区和DsGPDH1的5'UTR。用RT-PCR方法鉴定该5'UTR区，引物为CKPs(位于5'UTR)和CKPa(位于1.1kb片段)，得到产物为400bp的片段，将该片段和1.1kb片段，EST和1.7kb片段进行拼接，得到了一条长2831bp cDNA序列，该cDNA序列包含一个长1851bp的ORF(图1)。采用RT-PCR，用引物ORFP和ORFPa对假定的ORF序列进行了克隆鉴定，产物为1851bp，测序显示其序列正确。
1.2DsGPDH1序列分析
克隆获得的cDNA长2831bp，包含完整的ORF，部分5'UTR以及整个3'UTR序列。ORF序列大小为1851bp，能够编码含有617个氨基酸的多肽。DsGPDH1与已发表的DsGPDH2的氨基酸序列进行比对显示出高度的同源性。和DsGPDH2一样，这条617个氨基酸的多肽链包含了一个位于N末端的SerB结构域和一个位于C末端的GPDH结构域(图2A)。亚细胞定位预测显示DsGPDH1不含有信号肽，因此，本研究提出DsGPDH1是一种胞质蛋白，即DsGPDH1是胞质型GPDH(图2B)。
1.3DsGPDH1的纯化与性质鉴定
镍柱能够从工程大肠杆菌细胞裂解液里吸附大盐藻胞质型3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆及性质鉴定4123
基因组学与应用
生物学
图1DsGPDH1的启动子区
注：斜体加黑的部分(520~569)：预测的启动子；字号加大且带深灰背景的字母A：预测的转录起始位点；带下划线的“ATG ”(663~665)：预测的起始密码子；浅灰背景部分(613~639)：引物CKPs 对应的位点Figure 1The promoter region of DsGPDH1
Note:The italic blackened part (520~569):The predicted promoter;The larger letter A with dark gray background:The predicted transcription start site;The underlined "ATG"(663~665):The predicted start codon;The light gray part (613~639):The binding site of the primer CKPs
量的蛋白，经过sds-page 分析，镍柱所吸附的蛋白的分子量介于60kD 和70kD 之间，大小和预期的68kD 相符合(图3)，收集该目标蛋白，浓缩后，采用分子筛进一步纯化，经过分子筛，目标蛋白获得了很好的纯度，该纯化蛋白用于酶活性分析。分子筛也进一步显示，该融合蛋白为单亚基。很遗憾的
是该融合蛋白没有NADH 依赖的脱氢酶的活性，本研究采用了试剂盒检测酶反应液里的甘油和磷酸根，但遗憾的是目前市场上的几种试剂盒都不适合本研究的实验，原因是试剂盒里的强酸试剂会导致3-磷酸甘油上的磷酸基团释放出来，所以本研究不能确定融合蛋白SerB 结构域有没有磷酸化酶的活性，后续会进一步测定。1.4DsGPDH1与DsGPDH2在盐胁迫期间的表达
高盐胁迫(3.5mol/L NaCl)可显著诱导DsG-PDH1与DsGPDH2mRNA 的表达，并在胁迫2h 左右达到最大值，此时的mRNA 的量大约是未胁迫时的5.5倍，随后表达开始下降，DsGPDH1在16h 左右恢复到未诱导时的水平；DsGPDH2在2h 后虽然也开始下降，但在24h 时，其表达值仍然显著高于未诱导时。低盐胁迫(0.5mol/L NaCl)可大大抑制DsG-PDH1的表达，
并在胁迫1h 左右达到最大抑制，此时DsGPDH1的表达只有未诱导时的6%左右。随后，其表达值开始回升，但是在24h 时的表达值还是明显低于未诱导时的值；反观DsGPDH2，低盐胁迫对其表达似乎有一点抑制作用，但是不是很明显(图4)。
2讨论
本研究确定DsGPDH1融合蛋白没有NADH 依
赖的脱氢酶的活性，但是本研究不能确定其是否具有3-磷酸甘油磷(G3P)酸化酶的活性，也有可能Ds GPDH1具有G3P 酸化酶的活性，毕竟G3P 是一个
很重要的代谢中间物，如果DsGPDH1既没有脱氢酶
的活性，
又没有磷酸化酶的活性，那它对细胞似乎就没有作用了。
高渗胁迫可以显著诱导DsGPDH1与DsGPDH2的表达，但低盐胁迫却对DsGPDH2的表达没有显著影响，只是大大抑制DsGPDH1的表达。这说明Ds-GPDH1与DsGPDH2都参与了高盐胁迫时甘油的合成，只是DsGPDH2定位于叶绿体，而DsGPDH1定位于细胞质。但在甘油分解时(低盐胁迫)，DsGPDH1的表达被抑制，如果DsGPDH1具有磷酸化酶的功能，这就暗示甘油分解时盐藻细胞需要防止胞内大量的G3P 被DsGPDH1转化为甘油。Gee 等(1993)认为杜氏藻中有三种GPDH 同工酶，其中有两种位于叶绿体中，第三种则位于细胞质中，并按推测的功能命名为：(1)叶绿体渗透调节型，在甘油合成中发挥作用；(2)叶绿体甘油型，在脂质合成中起作用；(3)胞质甘油酯型，也在脂质合成中起作用(Ghoshal et al.,2002)。结合Gee 等(1993)的分析，认为DsGPDH2符合叶绿体渗透调节型的描述，而DsGPDH1虽然位于胞质，但由于其没有脱氢酶的活性，所以不符合胞质甘油酯型的特征。由于DsGPDH1是否具有磷酸化酶的活性还不清楚，其功能也还有待进一步的研究。
冯永军3材料与方法
3.1藻类与生长条件
杜氏盐藻菌株CCAP 19/25(D.salina strain CCAP 19/25)从Mariela A.Gonz ález 和Thomas Pr 觟schold 处获得。藻类生长在光照培养箱里，条件设定为25℃光照14h ，20℃黑暗10h 。生长培养基的组成为0.5mol/L(低盐培养基)或3.5mol/L(高盐培养基)NaCl,5.0mmol/L NaNO 3，5.0mmol/L MgSO 4·7H 2O ，0.1mmol/L NaH 2PO 4·2H 2O ，1mmol/L KCl ，10mmol/L
4124
盐藻胞质型3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆及性质鉴定NaHCO 3，0.3mmol/L CaCl 2·2H 2O 和微量元素混合物。参照Pick 等(1986)对于高盐胁迫处理，采用生长于低盐培养基(0.5mol/L NaCl)的藻，往培养基里直接添加NaCl ，使藻液培养基的NaCl 浓度达到3.5mol/L ，然后在不同时间点取一定量的藻细胞提取总RNA ，
用于Real-time PCR 实验；
对于低盐胁迫处理，采用生长于高盐培养基(3.5mol/L NaCl)的藻，往培养基
里直接添加不含NaCl 的培养基，使藻液培养基的NaCl 浓度达到0.5mol/L ，然后在不同时间点取一定量的藻细胞提取总RNA ，用于Real-time PCR 实验。
3.2盐藻中DsGPDH1表达序列标签(EST)的分离
本研究对该盐藻藻种进行了转录组测序，并对测出的序列进行了注释，与BLAST 序列相似性分析，最终到了一条表达序列标签(EST)。基于该EST ，本研究设计了一对引物，用于扩增并验证该EST ，该图2DsGPDH1和DsGPDH2的比较
注:A:DsGPDH1和DsGPDH2的氨基酸序列比对，灰背景：氨基酸序列一致；黑线框:SerB 结构域；单下划线:GPDH 结构域；双下划线：预测的信号肽区域;B:DsGPDH1和DsGPDH2的结构域对比;DsGPDH1和DsGPDH2都拥有完整的SerB 结构域和GPDH 结构域，只是DsGPDH2比DsGPDH1多了一段信号肽Figure 2The comparison of DsGPDH1and DsGPDH2
Note:A:The amino-acid sequence alignment of DsGPDH1and DsGPDH2;Gray color:The identical amino acid residues;Black box:The SerB domain;Underline:The GPDH domain;Double underlined:The predicted signal peptide;B:Domain comparison between DsGPDH1and DsGPDH2;Both DsGPDH1and DsGPDH2contain the entire SerB domain and the entire GPDH domain;However,DsGPDH1lacks the signal peptide compare to
DsGPDH2
对引物为：EstPs (5'-CAAGGTCAAGCGAGATGCC -3')和EstPa (5'-CGTCAGGCCCTGGCGCATGA -
3')。为了区分之前克隆的DsGPDH2，该GPDH 被命名为DsGPDH1。3.3cDNA 末端的快速扩增(RACE)
EST 的3'端采用3'RACE 的方法进行克隆(试剂盒,3'-Full RACE Core Set,TaKaRa)。EST 的5'端采用5'RACE 的方法进行克隆(试剂盒,SMARTer RACE 5'/3'kit,Clontech)。采用Trizol 试剂(Invitrogen)进行盐藻总RNA 的提取。
对于3'RACE ，使用Oligo-dT 引物(TaKaRa)进行
cDNA 第一条链的合成，用以下基因特异性引物进行DsGPDH1cDNA 的3'末端的PCR 扩增：3RPs1(5'-C TCTGGCAACTTGGAAGAGGTGGC -'3)，3RPs2(实际为EstPs)(5'-CAAGGTCAAGCGAGATGCC -3')和4125高四
基因组学与应用
生物学
西门豹治邺翻译
图3DsGPDH1纯化过程的SDS-PAGE
注:A：从亲和层析得到的蛋白质样品的SDS-PAGE;M:PH0304宽分子量蛋白Marker);1:10倍稀释的4号洗脱管;2：穿透;3：粗提液;4~13:4~13号洗脱管；目标蛋白条带位于60~70kD 之间;B：分子筛层析电泳;1~9:1~9号收集管；目标蛋白得到了很好的纯化Figure 3SDS-PAGE of protein samples from purification process of DsGPDH1
Note:A:SDS-PAGE of protein samples from affinity chromatography;M:PH0304wide molecular weight protein Marker;1:Elution fraction 4(10times diluted);2:Flow-through;3:Crude extract;4~13elution fraction 4~13:The MW of the target protein is between 60~70kD;B:Molecular sieve chromatography;1~9:Elution fraction 1~9;The target protein is highly
purified
图4DsGPDH1和DsGPDH2的胁迫诱导表达
铁路贯通线的作用注:A：高盐胁迫;B：低盐胁迫；将诱导0h 的表达值设为1，其它时间点的表达为1的倍数Figure 4Inducible expression of DsGPDH1&DsGPDH2
Note:A:Hyper-saline stress;B:Hypo-saline stress;The expression values on 0-hour were set to 1,and the expression values on other time spots were the folds of 1
3sites Adaptor primers (TaKaRa 公司)(TaKaRa)。采用cDNA 为模版，使用引物3RPs1和3sites Adapt
or inner primer 进行第一轮PCR 扩增；第一轮的扩增产物以1∶100的比例稀释后用作第二轮PCR 扩增的模版，并用引物3RPs2和3sites Adaptor inner primer 进行第二轮扩增。扩增片段克隆至pMD18-T 载体，并送出测序。
对于5'RACE ，第一条cDNA 合成采用引物为5'-CDS primer A (Clontech)和SMARTer ⅡA primer
(Clontech)共同存在的情况下进行反转录。用以下引物进行DsGPDH1cDNA 的5'末端的PCR 扩增：5RPa1(5'-GACCGCCCCCATTTCTCTGCTGGATG A -3')，
5RPa2(5'-GGCCACGTTCCCTCCTATGAGCA CGCTG -3')和通用引物混合物UPM (Clontech)。
以cDNA 为模版，采用引物5RPa1和UPM 进行第一轮PCR 扩增，第一轮PCR 产物以1∶100的比例稀释后作为第二轮PCR 的模版，并用引物5RPa2和UPM 进行第二轮的扩增。扩增片段克隆至pMD18-T 载体，并送出测序。3.4染体步移
由于5'RACE 方法无法获得DsGPDH1cDNA
的全长5'端，因此使用染体步移技术继续扩增Ds-GPDH1的5'端，直至其启动子区域，然后用两个基因特异性引物通过RT-PCR 的方法对转录起始位点进
4126
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