现物医学biomecLcnjournals«com Progress in Modem Biomedicine VoL21 N O«3 FEB*2021•407 •doi: 10.13241/jki.pmb.2021.03.002
沈梦君1董凯2韩厦1赵宇阳1徐东亮UA
(1上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科上海200080;2海军军医大学上海200433;
3海军军医大学附属长征医院泌尿外科上海200003)
摘要目的：探讨肾透明细胞癌的分泌蛋白丨GFBP3对癌旁脂肪细胞分化的作用及通过脂肪细胞促进肾透明癌细胞生长与转移的 作用。方法：通过肾细胞癌的基因数据库发现过表达的基因IGFBP3，免疫组化和RT-PCR确认IGFBP3在标本中的表达.RT-PCR 和Western Blot检测丨GFBP3对脂肪细胞分化成熟特征标志物表达的影响。以过表达1GFBP3的786-0细胞为模型，Western Blot 检测IGFBP3的促脂肪细胞分化作用与TGFp-smadl/5/8及TGFp-p38M APK信号通路的关系。将过表达IGFBP3的786-0细胞 与脂肪细胞共培养得到条件培养基，通过油红染检测条件培养的肾癌细胞中脂滴含量，迁移实验和C C K8实验分别检测脂肪 细胞对肾癌细胞侵袭性及增殖的影响结果：相较于正常组，肾癌标本中IGFBP3的表达增加(户=0.0丨7)。《^8?3使脂肪细胞分化成熟相关标志物PPAR7、P G C la、c/EBPa、Prdml6、U C P l 表达增加。以丨GFBP3处理脂肪细胞时，可以增加TGF(3下游蛋白表达 水平，30 min后p-smadl/5/8表达增加(P=0.024),60 min后p-p38M APK表达明显增加(P=0.013);，条件培养后的786-0细胞内的脂 滴形成增加〇P=〇.〇28)，脂肪细胞促进786-0细胞的增殖和迁移能力。结论:IGFBP3是肾透明细胞癌中过度表达的蛋白，能够促进 前脂肪细胞分化，其机制主要通过激活TG Fp通路中的smadl/5/8、p38MAPIC。成熟的脂肪细胞能够促进肾癌细胞质脂滴形成，并且促进肿瘤的增殖、提高肿瘤的侵袭性。
关键词:IGFBP3；脂代谢；脂肪细胞；肾细胞癌
中图分类号:R-33; R737.l l文献标识码：A文章编号：1673-6273(2021 )03-407-07
IGFBP3 Enhances Proliferation and Migration Capability of Renal
Carcinoma Cell via Adjacent Adipocytes*
SH ENM eng-jun1，DONG K a f，H A N Sha1，ZHAO Yu-yang1，XU Dong-liangU A
(1 Department o f U rology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School o f M edicine, Shanghai, 200080, China;
2 Second M ilitary M edical University, Shanghai, 200433, China;
3 Department o f U rology, Changzheng Hospital, Second M ilitary
M edical University, Shanghai, 200003, China)
ABSTRACT Objective:To investigate the mechanisms of IGFBP3 in the action on adjacent adipocytes and the effect of adjacent adipocytes on the proliferation and migration capability of clear cell renal cell carcinoma(ccRCC).Methods:IGFBP3 was found to be overexpressed in the database of ccRCC,which was verified in the specimen of ccRCC.RT-PCR and Western Blot were used to detected the biomarkers of adipocytes.Renal carcinoma cell line786-0 cell overexpressing IGFBP3 was used as cellular model and western blot was used to detect the effect of IGFBP3 on TGFp-smad1/5/8 and TGF p-p38MAPKpathway.Conditioned medium was prepared via cocultivation of786-0 overexpressing IGFBP3 and preadipocytes.Oil red staining was used to detect the contents of lipid droplets in renal carcinoma cell.Transwell and CCK8was used to detect the effect of adipocytes on migration capability and proliferation of renal carcinoma cell.Results:The expression of IGFBP3 markedly increased in the specimen of renal cell carcinoma(P=0.017). IGFBP3 promoted the differentiation of preadipocyte after activating smadl/5/8 (P=0.024) and p38MAPK(P=0.013). The contents of lipid droplets increased in786-0 cell cultivated in the conditioned medium(P=0.028) and migration capability and proliferation of786-0 were promoted. Conclusions:IGFBP3,overexpressed in
renal cell carcinoma,promoted the expression of preadipocyte by activating smadl/5/8 and p38MAPK.Mature adipocytes could increase the contents of lipid droplets and promoted migration capability and proliferation of renal cell carcinoma.
Keywords:IGFBP3;Lipid metabolism;Adipocyte;Renal cell carcinoma
Chinese Library Classification(CLC):R-33; R737.ll Document code:A
Article ID: 1673-6273(2021)03-407-07
*基金项目：申康医院研究发展中心基金项目(SHDC12014215)
作者简介：沈梦君（1994-)，男，硕士研究生，主要研究方向：肾癌，E-mail:mjshl123@163
A通讯作者：徐东亮（1976-)，男，博士生导师，教授，主要研究方向：肾癌，E-mail:urologistdlx@126，电话：139****9767
(收稿日期:2020-05-31接受日期：2020-06-26)
• 408 •现物医学biomed.ciyoumals Progress in Modem Biomedicine VoL21 N O>3 FEB>2021
刖目
肾细胞癌位于男性肿瘤的第6位，其死亡率为5.6/10万％ 肾透明癌细胞(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾细胞 癌的最常见病理类型P I，患者希佩尔-林道基因(Von-Hip-pel-Lindau，VHL)大多表达异常，导致低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)的堆积 ，从而弓| 起 cyclinDl 、EGFR、TGF〇i 等时上调。针对pVHL-HIF-VEGF通路的药物已成为一线 方案[M1，但目前可供选择的药物较少，且存在脱靶和耐药的问 题19#。脂肪细胞与肿瘤细胞之间有着许多重要联系，包括供 能、抗凋亡、通过旁分泌途径促进成瘤或血管生成等_21。目前 已证实肥胖是肾细胞癌的危险因素但仍缺乏肾周脂肪的相关研究。
通过Oncomine数据库的分析发现IGFBP3在ccR C C中高表达。临床研究发现患者存在不同基因型的IGFBP3，A A型 的患者具有更高的肾细胞癌患病风险，同时发现A A型基因与 病理分期有关〜61。鉴于IGFBP3能够促进棕脂肪细胞的生 长和分化1171，本次研究发现肾透明细胞癌过度表达IGFBP3，并 通过IGFBP3促进癌旁脂肪细胞分化，进而由成熟的脂肪细胞 促进肾癌细胞的生长与转移，结果报告如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物人肾癌细胞系786-0由上海交通大学附属 第一人民医院泌尿外科研究所提供。C57BL/6小鼠(6-7 w)购于上海杰思捷实验动物有限公司。
1.1.2组织标本选取2017年12月至2018年5月的手术标 本28例，经术后病理证实，14例为肾透明细胞癌患者，14例为 肾囊肿患者，分别取肿瘤组织和正常肾组织，脂肪组织选取周 围脂肪组织和远端(腹膜)脂肪组织。
1.1.3实验试剂及仪器合成h-IGFBP3单体、T3、Insulin、DEX、IBMX、卩引嗓美辛购自美国Sigma-Aldrich公司，过表达 1GFBP3慢病毒载体购自上海纽恩生物科技有限公司，】GFBP3抗体、pSmadl/5/8 抗体、Smadl/5/8 抗体、p-P38 MAPK 抗体、P38 M APK抗体、p-actin抗体、UCP1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，LDN-193189、SB431542 购自美国 Sell-eck Chemicals，油红染试剂盒购自上海想康生物科技有限公 司，引物、甲醇、氯仿、无水乙醇、异丙醇购自上海Sango Biotech，30 %丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、Tween20、CCK8 试剂盒购自上海碧云天公司，RT-PCR试剂盒购自美国Thermo Rsher Scientific公司，免疫组化试剂盒购自陕西普罗安蒂生物 科技发展有限公司。PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，Transwell小室购自美国康宁公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2方法
1.2.1免疫组化使用免疫组化Elivision二步法检测IGFBP3 的表达。将切片脱蜡、水化，用P B S冲洗。对组织抗原进行修 复。加50 (xL的3 %双氧水，室温下孵育10 min。P B S冲洗后加 人50 p L封闭液，室温孵育30 min。除去封闭液，加50 jxL IGFBP3抗体，室温下孵育60 min。P B S冲洗，加50 p L聚合物 增强剂，室温下孵育约20 min,P B S冲洗3次，每次约5 min，加50 (xL酶标抗体，室温下孵育20 min。P B S冲洗，加人50 |xL 新鲜配制的D A B溶液，显微镜观察10 min，当出现棕染而 背景无着时终止反应。用水冲洗，苏木素复染。
1.2.2油红染取目的细胞进行涂片，自然干燥后，将准备 好的细胞涂片置于配制好的油红染液工作液中，染约10min，用37 C预热的双蒸水洗涤约15 s；可以不用等待涂片上的水 完全干，用试剂盒中的水溶性封固液进行封片；镜检观察：组织 中的脂肪可被染成红，细胞核可被染成蓝。
1.2.3总RN A提取、逆转录-聚合酶链反应对于组织，切取 约25 g，加人TRIZOL试剂1mL，然后使用组织强力均质机使 其均质化；对于细胞,6孔板中加入TRIZOL试剂1mL，并通过 移液抽吸拍打几次促进细胞的裂解。提取样品中的RNA，溶 解RN A并检测其浓度。根据RT-PCR试剂盒配制反应体系，逆 转录得到目的cDNA，于-20°C保存。根据相关基因的cDNA 序列设计引物：
Genes Names IGFBP3
PPARy
PGCla
c/EBPa
Prdml6
UCP1
36b4
表1引物序列
Table 1Primer sequences in this study
山乡盼着你们来Forward primers
CCAGGAAACATCAGTGAGTCC
CTCCAAGAATACCAAAGTGCGA
TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT
雨靴里的麻雀
CAAGAACAGCAACGAGTACCG
CCAAGGCAAGGGCGAAGAA
AGGCTTCCAGTACCATTAGGT
AGATTCGGGA 丁A TGC 丁G TTGGC
Reverse primers
GGATGGAACTTGGAATCGGTCA
GCCTGATGCTTTATCCCCACA
CCACTTCAATCCACCCAGAAAG
GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
AGTCTGGTGGGATTGGAATGT
CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT
TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
完成定量PCR后，得到各基因的C T值，其中以稳定表达 的基因36b4为内参基因，计算各基因表达情况。
1.2.4分离小鼠原代棕脂肪及其培养选取6-7周的 C57BL/6小鼠。无菌条件下取下小鼠肩胛部棕脂肪，放人培养皿中，清洗3次。充分剪碎组织，放人消化液中消化。将消化 液过滤后，以1800 ipm离心5 min，弃去上清，加人DMEM培 养基（20 %FBS)制成细胞悬液。取少量细胞悬液，计数，调节 细胞密度。1〇4密度接种于培养皿中，以DMEM培养基（20%
现代生物医学进展 biomedjoumal8 Progress in Modem Biomedicine Voi21 N O >3 FEB<2021
.409 •
P < 0.001
D
A 0.001
FBS )培养至汇合成层(记为第0天）。
第〇天起加人含不同剂量IGFBP 3的诱导剂，（1)实验组 为 DMEM 培养基 + 20 % FBS + 1 nM T 3 + 20 nM + 5 M DEX + 0.5 mM IBMX + 250、500、1000 ng/ml rhIGFBP 3, (2)阴性对 照组为 DMEM 培养基 + 20 % FBS + 1 nM T 3 + 20 nM insulin +5 M DEX + 0.5 mM IBMX , (3)阳性对照组为DMEM 培养基+ 20 % FBS + 1 nM T 3 + 20 nM insulin + 5 M DEX + 0.5 mM IB - MX +0.125 M 吲哚美辛。2天后换液，将培养基改为DMEM 培养基 + 20 % FBS + 1 nM T 3 + 20 nM insulin 。之后，每隔 2 天 为细胞换一次液，直至第10天。分别于0 d 、2 d 、4 d 、8 d 、10 d 显 微镜下观察胞质内脂滴的大小和数量，使用酶标仪行定量分析。 1.2.5慢病毒感染肾癌细胞提前1天将培养状态良好的 786-0接种于24孔板，细胞密度为lOVmL ，保证第2天肾癌细 胞的细胞汇合率能达50 %左右。移去肾癌细胞的培养基，加人6 (xg/mL Polybrene 0.5 mL ，可促进慢病毒的感染。从-80 °C 冰 箱中取出慢病毒，先置于冰上慢慢融化，弃去细胞原有培养基 并加入250 |x L 混有病毒原液的培养基。后持续感染4 h ，4 h 后 再加人250 p L 该培养液。选用3 pg /m L 的嗓呤霉素进行筛 选。每3天更换1次含有嘌呤霉素的完全培养基，直到没有感 染的对照组细胞被完全杀死。传代筛选后的细胞，过程中继续 使用嘌呤霉素，在连续传代3次后可进行冻存。
1.2.6 Transwel 丨实验 选取病毒转染的786-0细胞，Western Blot 定量检测转染细胞培养基中的IGFBP 3蛋白水平。将肾癌 细胞和脂肪细胞进行共培养，上层细胞为原代棕脂肪细胞， 下层细胞为对照组细胞(空载）、单独的肾癌细胞、过表达IGF - BP 3的肾癌细胞、过表达IGFBP 3的肾癌细胞+ I
光对鼠妇生活的影响GFBP 3的中 和抗体。检测实验组和对照组中PPAR ~y 、PGCla 、c /EBP a 、 Prdml6、UCP 1 的 mRNA 水平。Western Blot 定量分析 UCP 1 的 蛋白水平。分别于〇(1、2(1、4(1、8<1、10(1显微镜下监测胞质内 脂滴情况。
，
通过共培养可以得到条件培养基，根据条件培养液的不同
共分4个实验组,A 组为过表达IGFBP 3的786-0细胞+脂肪 细胞,B 组为786-0细胞+脂肪细胞，C 组为过表达IGFBP 3的 786-0细胞,D 组为786-0细胞。肾癌细胞经过条件培养基培 养后行迁移实验：用胰酶消化786-0细胞，充分消化后离心，可 见细胞分层，去除上清液。四组细胞需要用不同的条件培养液 稀释，细胞密度约为5x 1〇4个/mL 。接着取IOO j j l L 细胞悬液置 于小室内培养。下室放置完全培养基，注意小室与下层培养板 之间不能留气泡。将细胞置于培养箱内培养48 h 。取出小室，去 除小室内的培养液后，用PBS 清洗2遍，甲醛固定20 min ，等待 其风干。结晶紫染20 min ，再去除上层未发生迁移的细胞，最 后用无菌的P B S 冲洗3遍。
1.2.7 CCK 8实验将处于对数生长期的786-0细胞加人24 孔板中。与迁移实验相同，细胞共分成4个实验组，每组细胞有 3个复孔。将其置人37 X ： ,5 % C 02的培养箱培养，细胞处理后 应每天在同一时间点进行观察。检测时，将CCK-8和PB S 的混 合溶液加人到各孔中。孵育2 h 后，用酶标仪(波长450
nm )测 定每孔的吸光度值，最后绘制细胞生长曲线。1.3统计方法
采用GraphPad Prism 7.0对实验数据进行统计分析，采用 平均数±标准差(mean ± SD )表示。若两组间差异性比较，采用 独立样本t 检验,P <0.05认为两者差异具有统计学意义。纯战略纳什均衡
2结果
2.1 IGFBP 3在肿瘤标本中表达增加
免疫组化的结果显示肿瘤组的肾癌细胞相较于正常细胞 IGFBP 3表达增加(户0.017，图1A )。RT-PCR 检测结果显示肿 瘤组织中IGFBP 3的基因表达增加（图1B )。对于棕脂肪细胞 标志物UCP 1的检测，无论与非肿瘤组比较还是与远端脂肪组 织比较，肿瘤周围脂肪组织都有UCP 1的表达增加(P <0.001, 图1C 、D )，表明癌旁脂肪组织中表达UCP 1的成熟棕脂肪细 胞增加。
A
->(V 6
i d i Z : *
P<0.001
Normal
Tumor
168dy
图1 IGFBP3和UCP1在标本中的表达
Fig. 1 Expression of 1GFBP3 and UCP1 in the specimen
c
o l «»w »J d
粘着语M o »«A U («l •
0:
c
• 410 •现代半物疾学讲展biomedjournals Progress in Modern Biomedicine VoL21 N O*3 FEB«2021
2.2 IGFBP3体外促进棕前脂肪细胞分化
我们主要选取小鼠的原代脂肪细胞，实验组中加人不同剂 量的(250、500、1000 ng/mL)，而阳性对照组中加人已明确有促 脂肪细胞分化的吲哚美辛。在分化第1〇天对棕脂肪相关基 因检测（见图2A)，发现相较于阴性对照组，加人IGFBP3或吲 哚美辛后卩?八117、？〇(：1£1、<；疋8?〇(的1111^八水平明显较高，包 括棕脂肪细胞的特征性标志物Prdml6、UCP1，两者也有明 显差异。除此之外，根据图2B，IGFBP3的效应存在明显的剂量依赖性，随着剂量的增加，IGFBP3的促分化作用也随之提高，但当剂量达到500 ng/m L后，这种效应也减少。分别于0 d、2 d、4d、8d、10d这几个不同时间段，观察脂肪内的脂滴含量，通 过油红染我们发现在加人丨GFBP3或吲哚美辛后，分化
成熟 的脂肪细胞脂滴含量增加，这种变化在脂肪细胞分化的第8天 最为明显。在第10天，通过Western Blot分析发现IGFBP3使 棕脂肪的标志物UCP1表达增加(见图2C)，表明IGFBP3能 够使脂肪细胞的成熟分化相关标志物表达增加。
"///
|*1** *
/// //
C
UCP1
B-actin
control 250
IGFBP3貪* *
blLi
图2 IGFBP3在体外能够促进棕脂肪细胞的分化
Fig.2 IGFBP3 promoted differentiation of brown adipocytes in vitro
Notes: Data were expressed as mean ± SD, *尸<0.05, compared with the control group; BP3 represents IGFBP3; indo represents indometacin.
2.3 IGFBP3可由肾癌细胞分泌促进脂肪细胞分化
通过transwell实验将肾癌细胞与脂肪细胞共培养，模拟 IGFBP3有肾癌细胞分泌作用于脂肪细胞的过程。图3A中可 以看到构建的基因重组细胞系过度表达IGFBP3。在图3B中，与过表达丨GFBP3共培养的脂肪细胞PPAR7、PGCla、c/EBPa 的mRNA水平明显较高，同时棕脂肪细胞的特征性标志物 Prdml6、U C P l也明显升高，而对照组细胞并没有类似的效应。再加人IGFBP3的中和抗体后，可以明显看到相关基因的表达 明显调低。分别于0 d、2 d、4 d、8d、10 d这几个不同时间段(见 图3C)，观察脂肪内的脂滴含量，在8d时过表达IGFBP3组的 脂肪细胞内的脂滴含量明显升高，而加人中和抗体后细胞内脂 滴含量降低。在图3D中，作为棕脂肪的标志物UCP1也在过 表达IGFBP3的肾癌细胞的作用下表达增加，而且与其他组相 比有明显差异。因此，过表达K3FBP3的肾癌细胞能够使脂肪 细胞分化成熟特征性标志物升高，并提高脂肪细胞内脂滴含 量。
2.4 IGFBP3 激活 TGFp通路
图4A中，加人IGFBP3后30 min时p-smadl/5/8的表达开始明显增加；同样地，图4C中，加人IGFBP3后60 min时 p-p38M APK的表达开始明显增力D(P=0.013)。可见IGFBP3能 够激活TG Fp的下游通路，从而促进脂肪细胞的分化。在加入 相应的TGFp抑制剂，结果显示着这种效应可以被阻断，说明 IGFBP3通过T G Fp通路作用于下游的smadl/5/8、p38MAPK。定量分析(图4B、D)发现在开始反应后30 min起，p-smadl/5/8 (P=0.024)和 p-p38MAPK(P=0.033)的表达量相较于 0 min时存 在明显统计学差异。
2.5脂肪细胞促进肾癌细胞的增殖和侵袭
图5显示过表达IGFBP3的786-0细胞与脂肪细胞共培 养后，其条件培养基处理后的肾癌细胞脂滴明显多于其他3 组。空载的786-0并没有相同的作用(P=0.028)，说明IGFBP3 对脂肪细胞的作用在其中起到关键性作用，但相较于其它两组 仍有上升趋势，说明脂肪细胞对肾癌细胞形成脂滴有一定的作 用。786-0细胞本身具有一定侵袭性，但是图6A、B显示在脂肪 细胞的作用下，迁移的肾癌细胞的数量高于其他两组，尤其是 在过表达IGFBP3的肾癌细胞作用后。细胞计数后发现该组的 肾癌细胞的迁移数量与对照组相比有显著性差异。图4C
中过
现学biomecLcnjournals^om Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO*3 FEB*2021• 411 •表达IGFBP3的共培养组的存活细胞数明显高于其他三组，可见脂肪细胞对肾癌细胞增殖的促进作用。
图3由肾癌细胞分泌的IGFBP3能够促进脂肪细胞分化
Fig.3 IGFBP3 secreted by renal carcinoma cell promotes differentiation of adipocytes Notes: Data were expressed as mean 士SD，*尸<0.05, compared with the control group; OV represented overexpression; Ab represented antibody of
IGFBP3.
A Time (min)
0 15 30 60 90 0 15 30 60 90
P-smadl/5/8
Total smadl/5/8
IGFBP3 十
LDN-193189 十
C Tim© (min)
0 15 30 60 90 0 15 30 60 90
P- p38 MAPK Total p38MAPK ■■■■■■麟典應••雜••感壽
I6FBP3
SB431542 +
图4 IGFBP3激活TGFp通路
Time (min)
Fig.4 IGFBP3 activated TGFp pathway
Notes: Data were expressed as mean ± SD, *P<0.05, compared with 0 min; LDN-193189 was the inhibitor of smad 1/5/8; SB431542 was the inhibitor of
p38MAPK.
3讨论
对于某些肿瘤来说，脂肪细胞是肿瘤发生发展的重要微环 境，目前发现的主要有乳腺癌和腹腔转移瘤，如卵巢癌、结肠癌 等除了本身可以分泌信号分子，脂肪细胞还促进肿瘤的迁 移、粘附等，与肿瘤细胞进行能量物质的交换。脂肪细胞为肿瘤细胞提供脂肪酸，而肿瘤细胞通过脂肪酸氧化获取能量。本研 究中，我们对IGFBP3对前脂肪细胞分化的作用进行检测，发 现IGFBP3的促分化作用，推测IGFBP3通过增加成熟的脂肪 细胞促进肿瘤的进展。
脂肪细胞分化是一个复杂的过程,PPAR7是其中最重要 的调节因子，能与C/EBP
发挥协调作用使脂肪细胞保持其正
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议