聂鑫;高原
【摘 要】目的 了解粪肠球菌胶原黏附素A(AceA)基因及其编码蛋白的遗传变异情况,为筛选动物粪肠球菌性传染病诊断及保护性抗原基因奠定基础.方法 根据粪肠球菌B 343/TX2783株AceA基因序列设计引物,对粪肠球菌TLME3株总DNA进行PCR扩增,产物经胶回收试剂盒纯化回收,与pMD18- T连接,转化入E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆进行测序.使用Lasergene7.0、BLAST、MEGA 4.0等生物学软件,对克隆基因及其编码蛋白进行序列分析并生成系统进化发育树,计算基因核苷酸及编码氨基酸的变异率.结果 成功克隆了粪肠球菌TLME3株AceA基因,阅读框为918bp.与BLASTn和BLASTp搜索出的58个核苷酸和84个氨基酸同源序列的同源性均为96％～100％,氨基酸变异率为1.63％.结论 TLME3 AceA基因很保守,可以作为动物粪肠球菌性传染病诊断及保护性抗原候选基因.%For understanding the genetic variations of collagen adhesin AceA gene from E. faecalis, a candidate gene of diagnosis and protective antigen in infection of Enterococcus faecalis was screened. One pair of specific primers was designed according to the AceA gene from E. faecalis strain B- 343/TX2783, and the total DNA in E. faecalis strain TLME3 was amplified by PCR. Production was purified and recovered with gel extraction kit and connected with pMD18-T, then transformed into competent cells of E. coli DH5α and positive clones were selected for sequencing. The gene and its proteins were analysed and phylogenetic tree was reconstructed with biological-software such as Lasergene 7. 0, BLAST and MEGA 4. 0. Rate of variation of the nucleotide and the protein deduced by nucleotide were calculated. Results revealed that the AceA gene from E. faecalis strain TLME3 was successfully cloned, with an open reading frame of 918 bp. It shared 96%-100% sequence ho-mology with gene consists of 58 nucleotides and polypeptide composed of 84 amino acids searched by BLASTn and BLASTp. The mutation rates of amino acid were 1. 63%. The result showed that AceA genes from TLME3 were conserved, which could be used as a candidate gene of diagnosis and protective antigen in disease infection by Enterococcus faecalis.
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
rs触发器【年(卷),期】2012(028)008
【总页数】4页(P837-840)
【关键词】粪肠球菌;AceA;基因克隆;序列分析;系统进化发育树;诊断抗原;保护性抗原
【作 者】聂鑫;高原
【作者单位】内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042
【正文语种】中 文
zing tv【中图分类】R378.1
粪肠球菌是一种新的人兽共患病病原体［1］，它不但是引起医院内病人感染和死亡的主要致病菌［2］，而且动物感染粪肠球菌发病和死亡的报道也越来越多［3］。猪源粪肠球菌毒力岛基因与人源相关基因、致羔羊脑炎粪肠球菌毒力因子基因片段与医学临床中某些该菌的相关基因片段同源性很高，存在着基因水平转移或某种联系［4－5］。粪肠球菌感染
致死主要由其毒力因子所致。在粪肠球菌感染过程中，是由Ace介导黏附在宿主细胞外基质（ECM）蛋白上，完成定植和感染第一步的［6］。因此，Ace是粪肠球菌感染的最重要的毒力因子之一。
五星电器加盟1 材料与方法
1．1 菌株与载体 所用粪肠球菌TLME3株为本实验室从发生败血症的雏鹅体内分离并鉴定；E．coli DH5α为本实验室保存；pMD18－T克隆载体购于大连Takara公司。
1．2 工具酶及试剂 Taq酶购自Promega公司，限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、Proteinase K购于大连Takara公司，dNTPs、DNA DL2 000Marker、DNA DL10 000Marker、Solarbio凝胶回收试剂盒购自上海Solarbio生物科技公司，北京庄盟质粒小量抽提试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。其它化学试剂为国产分析纯产品。
1．3 引物设计与合成 根据GenBank上已发表的粪肠球菌B－343／TX2783株（注册号为 AF260896）的 AceA基因序列，用Primer Premier 5．6．0和 Oligo 6．71软件设计1对引物，引 物 序 列 为：上 游 引 物 P1（BamH Ⅰ ）：5′－CGCGGATCCAGATCACACTACT－3′，下游引物 P2（XhoⅠ）：5′－，由大连 Takara公司合成。
1．4 PCR扩增 PCR反应体系：ddH2O 14．3μL，10×PCR buffer1．5μL，2．5mmol／LdNTP 2．0μL，上、下游引物各2．0 μL，模板DNA3．0μL，Taq DNA Polymeras 0．2μL，总体积25μL。PCR反应条件：95 ℃，5min；94 ℃，1min；52 ℃，1 min；72℃，1min；共30个循环；72℃延伸7min。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1．5 PCR产物的克隆和测序 用Solarbio凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物与pMD18－T载体连接，连接产物转化入E．coli DH5α感受态细胞，涂布于铺有IPTG（0．1mol／L）和X－Gal（0．05mol／L）的LB的平板上，37℃培养过夜。进行蓝白斑筛选，挑取生长良好的白单个菌落进行增菌培养，用北京庄盟质粒小量抽提试剂盒提取重组质粒，进行BamH I、XhoI单、双酶切鉴定和PCR鉴定，阳性重组质粒命名为pMD18－T－AceA。筛选阳性重组质粒送大连Takara公司测序。
莲必治1．6 结构和序列分析 用Lasergene7．0及ANTHEPROT本地软件对粪肠球菌TLME3株AceA蛋白序列的组分、分子质量、滴定曲线与等电点进行预测；用Gene Runner软件，对TLME3株AceA蛋白序列一级结构中糖基化位点、磷酸化位点和硫酸化位点等修饰位点和模序进行预测；用同源建模服务器SWISS－MODEL在线软件，对TLME3株AceA蛋白的三
级结构进行预测。用NCBI上BLASTn和BLASTp在线软件对粪肠球菌TLME3株AceA基因核苷酸序列及其编码氨基酸序列进行同源性搜索；用Lasergene7．0中MegAlign程序，将测定的TLME3株AceA基因核苷酸序列及其编码氨基酸序列，与用BLAST在线软件搜索得到的其他粪肠球菌AceA氨基酸序列进行多重比对，并用MEGA4．0软件Phylogeny程序 Maximum Parsimony（MP）方法生成系统进化发育树；根据序列比对结果计算TLME3株AceA氨基酸序列的变异率。
2 结 果
2．1 目的基因的扩增 以粪肠球菌TLME3株DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到一个大小约957bp的条带，与预期结果一致，见图1。
dac基因图1 粪肠球菌TLME3株AceA基因的PCR扩增M：DNA分子质量标准；S1：TLME3AceA PCR扩增产物；S2：ATCC29200AceA PCR扩增产物Fig．1 PCR amplification of AceA gene from E．faecalis strain TLME3M：DL2000DNA Marker；S1：Amplified Product of AceA from TLME3by PCR；S2：Amplified－Product of ATCC29200AceA by PCR
2．2 重组质粒的鉴定 将粪肠球菌TLME3株阳性重 组 质 粒 pMD18－T－AceA 进 行 PCR 鉴 定、BamH I单酶切鉴定和BamH I、XhoI双酶切鉴定，结果见图2。图2中3 649bp的单酶切条带是pMD18－T－AceA全长序列，2 692bp和957bp的双酶切条带分别是载体条带和目的条带，与预期结果一致，表明目的片段已经成功地与克隆载体连接。
阳性重组质粒测序结果TLME3株AceA基因核苷酸长957bp，用Lasergene7．0EditSeq程序查的阅读框为918bp，编码306个氨基酸。将TLME3株AceA基因序列录入GenBank中，登录号为：JQ726492。
2．3 结构和序列分析
锚杆钻孔2．3．1 编码蛋白理化特性及一级和三级结构预测用Lasergene7．0对TLME3株AceA蛋白组分、分子质量、滴定曲线和等电点进行预测。
AceA含有19种氨基酸，其中Thr最多，其次为Glu和Asn，疏水性氨基酸Ala、IIe、Leu、Pro、Val和Trp共82个，占总数的26．8%；分子质量为36．09kD；滴定曲线上等电点为4．32，表明AceA是酸性蛋白。
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