作者：张佼蕊 贺丹 何松林 谢栋博 李朝梅 王政 刘艺平
来源：《江苏农业学报》2020年第06期
共产主义原理
摘要：为了探究芍药属不同种间远缘杂交不亲和的分子作用机制，以粉玉奴芍药自交授粉后24 h、36 h和粉玉奴芍药×凤丹白牡丹杂交授粉后24 h、36 h的柱头为材料，根据柱马尔斯
头转录组差异基因序列，采用逆转录（RT）-PCR技术，克隆得到SPL3基因的cDNA序列，将其命名为PlSPL3（GenBank登录号：MN842720），随后对其进行生物信息学分析和表达特性分析。结果表明，PlSPL3基因的编码区（Coding sequence，CDS）全长1 305 bp，共编码434个氨基酸。分析结果显示，PlSPL3蛋白是一种带负电荷的不稳定的亲水性蛋白质，无跨膜结构。蛋白质进化树显示，芍药PlSPL3蛋白的氨基酸序列与拟南芥AtSPL7蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性，同时芍药PlSPL3蛋白与木瓜、向日葵和无花果SPL3蛋白的氨基酸序列同源性也较高。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示，在自交、杂交授粉后不同时期的柱头中，PlSPL3基因在杂交授粉后36 h的相对表达量最高。研究结果为进一步阐明PlSPL3基因在芍药与牡丹远缘杂交不亲和中的生物学功能提供了理论依据。烟机备件
关键词：牡丹;芍药;PlSPL3基因;基因克隆;基因表达
中图分类号：S682.1+2文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）06-1537-06
Abstract：In order to explore the molecular mechanism of distant hybridization incompatibility in Paeonia， the stigmas from P. lactiflora Fenyunu × P. lactiflora Fenyunu
and P. lactiflora Fenyunu × P. ostii Fengdanbai were harvested as the materials after 24 h and 36 h of pollination. The cDNA sequence of SPL3 gene was cloned by reverse transcription （RT）-PCR technique based on differential gene sequence of transcriptome in stigma， and was named as PlSPL3 （GenBank accession No： MN842720）， the bioinformatics and expression characteristics of PlSPL3 were then analyzed. The results showed that 434 amino acids were encoded by the coding sequence of PlSPL3 gene with a length of 1 305 bp. Analysis results showed that PlSPL3 protein was a kind of unstable， hydrophilic protein with negative charges and without transmembrane structure. The results of phylogenetic tree indicated that the amino acid sequence of PlSPL3 protein from P. lactiflora had high homology with that of AtSPL7 protein from Arabidopsis thaliana， and the amino acid sequences of PlSPL3 protein in P. lactiflora were also highly homologous with those of SPL3 protein in Chaenomeles sinensis， Helianthus annuus and Ficus carica. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） results indicated that the relative expression level of PlSPL3 gene was the highest in stigmas at 36 h after hybridization. These results provide a theoretical basis in f
urther elucidating the biological functions of PlSPL3 gene in distant hybridization incompatibility between P. lactiflora and P. ostii.
Key words：Paeonia lactiflora;Paeonia ostii;PlSPL3 gene;gene cloning;gene expression
牡丹（Paeonia ostii）與芍药（Paeonia lactiflora）同属于芍药科芍药属，具有很高的园林观赏价值和经济价值[1]。芍药花艳丽、花型丰富、花期长，与牡丹并称为“花中二杰”[2]。芍药属的品种改良和育种工作一直是该领域科研和生产的主要内容，而杂交育种是芍药属育种工作采用的主要方法[3]。远缘杂交不仅可以丰富物种、提高植物的抗病性和抗逆性，还对花等性状具有改良作用[4]。1948年，国际上首次成功获得了牡丹、芍药的组间，并将其命名为Itoh，具有观赏价值高、抗性强等特点[5-6]。目前国内的芍药属远缘杂交研究还处于初级阶段[7]。花粉管的不正常生长、受精过程失败是影响芍药属远缘杂交的主要障碍[8]。王文和等[9-10]在百合远缘杂交的过程中观察到花粉管形态异常现象，并且发现在花粉管生长过程中伴随着胼胝质反应;郝津藜等[11]在黄牡丹远缘杂交亲和性研究中同样发现，不亲和花粉会导致花粉管及柱头组织中胼胝质沉积，从而阻碍花粉管
生长。牡丹与芍药远缘杂交的主要障碍是杂交不亲和，授粉后柱头对异源花粉的特异性排斥产生强烈的胼胝质反应，并且大部分花粉不能萌发，花粉管出现扭曲、肿胀等现象[3，12-13]。
SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）转录因子是花发育过程中一个重要的调控枢纽[14]，它参与花的早期发育、成花转变等，并调控植物大小孢子的发生和雌雄配子体发育以及花粉囊发育、花药开裂等[15-18]。SPL家族基因广泛存在于玉米、番茄、葡萄、牡丹等植物中[19-22]。在拟南芥的SPL转录因子中，氨基酸序列最短的是AtSPL3蛋白，由131个氨基酸组成。AtSPL3基因参与调控下游基因的表达，从而促进拟南芥开花[17，23]。SPL3基因主要在花序中表达，在适当条件下过量表达会导致花和花序发育异常[24];在拟南芥中，SPL2基因可以影响花粉的产量及生育力[25-26];SPL8基因可以影响大小孢子的发生、雄蕊花丝的延长、小孢子囊壁的形成及花药开裂，SPL8基因功能缺失会影响花粉囊发育，导致植株花序缩短并且影响植株的生育力[16，27]。
景德镇艺术瓷厂 笔者所在课题组前期对芍药属杂交育种进行了大量研究，发现粉玉奴芍药（P. lactiflora ‘Fenyunu’）自交亲和，粉玉奴芍药与凤丹白牡丹（P. ostti ‘Fengdanbai’）远缘杂
交不亲和，并且发现远缘杂交不亲和的关键时期为杂交后24 h、36 h[3，12，28]。在前期试验中，笔者以芍药自交授粉亲和处理为对照，通过转录组研究，筛选了相关差异表达基因，得出显著上调表达的SPL基因。本研究以芍药柱头为材料，分析其PlSPL3基因的cDNA全长序列，并对其基因及编码蛋白质的序列特征进行分析，检测芍药属自交亲和与杂交不亲和在授粉后不同时期该基因表达情况，以期进一步探索芍药PlSPL3基因的功能与生物学信息，同时为进一步探究芍药属远缘杂交不亲和的分子机制提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料母本芍药品种粉玉奴、父本牡丹品种凤丹白均由河南省优质花卉蔬菜种苗工程研究中心提供。在母本松蕾期进行去雄、套袋处理，去雄2 d后连续3 d进行3次人工授粉。随后取粉玉奴自交授粉后24 h、36 h的柱头与粉玉奴×凤丹白杂交授粉后24 h、36 h的柱头。将柱头用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中保存，随后进行RNA的提取。
1.2试验方法
1.2.1柱头总RNA的提取和cDNA的合成基于植物RNA提取的常规方法，使用天根生化科技（北京）有限公司的试剂盒进行柱头总RNA提取，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa）将RNA反转录成cDNA第一链，然后将产物于-20 ℃贮存。
1.2.2PlSPL3基因的分离克隆根据转录组结果获得的PlSPL3基因片段，从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）网站下载同源序列，进行基因比对分析，并在比对结果中寻同源性较高的序列用于设计特异性引物。以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。使用20 μl反应体系，组成如下：10 μl 2×fast Pfu master mix，1 μl Primer F，1 μl Primer R，1 μl cDNA，加ddH2O至总体积为20 μl。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，33个循环;72 ℃延伸10 min。所用引物与用途见表1。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用试剂盒（北京百泰克生物技术公司产品）回收目的条带，连接T载体后在感受态细胞中扩增，挑选阳性菌落进行测序，获得扩增的目的条带序列。
1.2.3生物信息学分析使用在线Nucleotide BLAST軟件对PlSPL3基因的同源性关系进
行分析。使用DNAMAN 8.0软件对PlSPL3基因编码蛋白质的氨基酸序列进行预测。用ProtParam、TMpred、SignalP 5.0 Server在线软件分析PlSPL3蛋白的理化性质、跨膜结构和信号肽信息。利用CDD在线软件分析PlSPL3基因编码蛋白质的结构域。利用GOR4软件预测PlSPL3蛋白的二级结构。使用MEGA 7.0构建系统发育树，Bootstrap值设置为1 000[29-30]。
1.2.4PlSPL3基因的表达分析分别以粉玉奴自交授粉后24 h、36 h和粉玉奴×凤丹白杂交授粉后24 h、36 h的柱头cDNA为模板，以β-Tubulin为内参基因（表1），使用SYBR Premix ExTaqTM试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司产品]，在ABI 7900 Real-Time PCR System仪（美国应用生物系统中国公司产品）上进行实时荧光定量PCR，引物序列见表1。实时定量反应体系及反应程序参照He等[12]的方法进行，每个反应包括3个生物学重复。用2-△△Ct法计算基因的相对表达量[31]。
2结果与分析
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2.1PlSPL3基因全长序列的克隆与分析
用转录组的差异基因片段设计的上下游引物进行扩增，测序结果表明，扩增得到了大小为1 305 bp的碱基片段，详见图1。
对芍药PlSPL3基因编码氨基酸序列进行BLAST比对分析，结果显示，其与向日葵、藜麦、葡萄、胡桃、木瓜等的SPL基因编码氨基酸序列的相似度达到72.0%～77.3%。随后，用DNAMAN 8.0软件推测芍药PlSPL3基因编码蛋白质的氨基酸序列。
用MEGA 7.0将芍药PlSPL3基因编码蛋白质的氨基酸序列与拟南芥SPLs基因编码蛋白质的氨基酸序列进行对比。由图2可以看出，芍药PlSPL3基因编码蛋白质与拟南芥AtSPL7基因编码蛋白质聚类到一起，表明该片段对应的基因为芍药的SPL基因，GenBank登录号为MN842720。
SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）转录因子是花发育过程中一个重要的调控枢纽[14]，它参与花的早期发育、成花转变等，并调控植物大小孢子的发生和雌雄配子体发育以及花粉囊发育、花药开裂等[15-18]。SPL家族基因广泛存在于玉米、番茄、葡萄、牡丹等植物中[19-22]。在拟南芥的SPL转录因子中，氨基酸序列最短的是AtSPL3蛋白，由131个氨基酸组成。AtSPL3基因参与调控下游基因的表达，从而促进拟南
芥开花[17，23]。SPL3基因主要在花序中表达，在适当条件下过量表达会导致花和花序发育异常[24];在拟南芥中，SPL2基因可以影响花粉的产量及生育力[25-26];SPL8基因可以影响大小孢子的发生、雄蕊花丝的延长、小孢子囊壁的形成及花药开裂，SPL8基因功能缺失会影响花粉囊发育，导致植株花序缩短并且影响植株的生育力[16，27]。
笔者所在课题组前期对芍药属杂交育种进行了大量研究，发现粉玉奴芍药（P. lactiflora ‘Fenyunu’）自交亲和，粉玉奴芍药与凤丹白牡丹（P. ostti ‘Fengdanbai’）远缘杂交不亲和，并且发现远缘杂交不亲和的关键时期为杂交后24 h、36 h[3，12，28]。在前期试验中，笔者以芍药自交授粉亲和处理为对照，通过转录组研究，筛选了相关差异表达基因，得出显著上调表达的SPL基因。本研究以芍药柱头为材料，分析其PlSPL3基因的cDNA全長序列，并对其基因及编码蛋白质的序列特征进行分析，检测芍药属自交亲和与杂交不亲和在授粉后不同时期该基因表达情况，以期进一步探索芍药PlSPL3基因的功能与生物学信息，同时为进一步探究芍药属远缘杂交不亲和的分子机制提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料母本芍药品种粉玉奴、父本牡丹品种凤丹白均由河南省优质花卉蔬菜种苗工程研究中心提供。在母本松蕾期进行去雄、套袋处理，去雄2 d后连续3 d进行3次人工授粉。随后取粉玉奴自交授粉后24 h、36 h的柱头与粉玉奴×凤丹白杂交授粉后24 h、36 h的柱头。将柱头用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中保存，随后进行RNA的提取。
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