• 38 •中国病原生物学杂志2021年1月第16卷第1期Joum al o f Pathogen Biology Jan. 2021，Vol. 16. No. 1
D O I：10. 13350/j. cjpb. 210108 •论著•
病毒感染时IFITM3与TRIM22和Foxp3表达及 吕洁1’2’3，齐新伟2，再海比亚•艾合买提、陈锋3，热比亚•努力'范佳惠1夂3，单骄宇，马秀敏
(1.新疆医科大学附属肿瘤医院检验科，新疆乌鲁木齐830011 ;2.新疆医科大学第一附属医院；3.新疆医科大学基础医学院）
【摘要】
________目的病毒感染时对IFITM3、T R I M22和F O X P3及基因进行富集分析。方法利用S T R I N G作出IF-
I T M3、T R I M22和F O X P3及其关联的50个基因互作网络图；利用D A V I D数据库和K O B A S数据库对其进行G O分析
和K E G G分析。应用荧光定量P C R对3基因的m R N A相对表达量进行相关性分析。结果通过S T R I N G数据库 分析得到3基因互作网络图，关联性大小与图中代表基因节点的圆圈大小呈正比（P<0. 05)。经基因功能富集分析表明基因相关的信号通路与基因有关联的可信度较高（P<〇. 05)。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和甲型流感病毒感染患者的外周血白细胞（P<〇. 05)分别为（4. 462±3. 441)、（4. 406±4. 415)和（4. 013士0. 081)中的 I F I T M3的m R N A与 健康对照组差异有统计学意义G=2.987，P<0. 01)。结论机体感染病毒后，I F I T M3与T R I M22之间、F O X P3与T R I M22之间可能存在着一定的相互作用，并参与机体对病毒感染的应答进程。 三结构域蛋白22；干扰素诱导的跨膜蛋白3；基因富集分析；病毒感染；相互作用
【关键词】
【中图分类号】R373【文献标识码】A【文章编号】1673-5234(2021)01-0038-06
[_]ournal o f Pathogen B io lo g y.2021 J a n；16(1)：38— 43.]
Relative expression of the IFITM3 and TRIM22 genes and enrichment analysis of related genes during infection with three viruses
LV Jie1.2.1，QI Xin-wei2, ZAIHAIBIYA •Aihemaiti3, CHEN Feng3，REBIYA •Nuli3, FAN Jia- hui' _’，
SHAN Jiao-yu'，MA Xiu—min1(1. Clinical Laboratory The A ff i li a t e d T u m o r H o sp ita l o f X in-j i a n g M edical U niversity U rum qi ^X in j i a n g ^China830011; 2. First H o sp ita l A ff i li a t e d w ith X in j i a n g M edical U-niversity；3. College o f Basic M e d ic in e，X in j i a n g M edical U niversity)
【Abstract】infection.
Objectives T o p e r f o r m e n r i c h m e n t analysis of I F I T M3,T R I M22,F O X P3,a n d related ge n e s during virus M e t h o d s T h e S T R I N G database w a s used to m a p the interaction n e t w o r k for I F I T M3,T R I M22,F O X P3,
a n d 50 related genes. T h e D A V I D a n d K O B A S databases w e r e used to p e r f o r m G O analysis a n d K E G G analysis of these gen e s a n d to identify their related signal p a t h w a y s a n d routes of viral infection. T h e relative expression of the 3 gen e s w a s analyzed using R T-P C R.Results T h e g e n e interaction n e t w o r k for I F I T M3,T R I M22,a n d F O X P3 w a s m a p p e d based o n a n analysis of the S T R I N G databavSe, a n d the size of the correlation w a s proportional to the size of the circle r epresenting the g e n e n o d e in the figure (P<C0. 05). G e n e function e n r i c h m e n t analysis indicated that influenza A,hepatitis C，
a n d hepatitis B p a t h w a y s are all related to gen e s in gene-related signaling p a t h w a y s w ith a high level of reliability (P<C0.
05). T h e signaling p a t h w a y w ith the highest degree of correlation to three gen e s is the T cell receptor signaling p a t h w a y.
I F I T M3m R N A w a s 4. 462士3. 441in peripheral blood leukocytes (P<0. 05) of patients infected wit h hepatitis B virus，
4. 406+ 4. 415in patients infected wit h hepatitis C virus, a n d 4. 013+0. 081in patients infected wit h influenza A virus. T h e difference in m R N A levels b e t w e e n patients a n d the healthy control g r o u p w a s significant (t = 2. 987,P<C0. 01). Conclusion T h e r e m a y be s o m e interaction b e t w e e n I F I T M3 a n d T R I M22 a n d b e t w e e n F O X P3 a n d T R I M22 that m a y be involved in the r esponse to a viral infection.
tripartite motif containing 22；interferon-induced t r a n s m e m b r a n e protein 3 ；g e n e e n r i c h m e n t analysis；viral infection；interaction
三结构域蛋白家族（tripartite motif, TRIM)是含有 RING(really interesting new geme)结构域的 RB- CC蛋白家族中的一类分子，已经发现的有近80个成
员。RING结构域具有E3泛素连接酶活性，而后者是 一类可以将泛素转移到底物上进行降解的酶，在细胞
【基金项目】_新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（No. 2017D01C216)。
* 國单骄宇，E—mail: shanjiaoyu2007@ sina. com; 马秀敏，E— m ail: m axium inl210@sohu. com
吕洁（1995_)，女，山东人，在读硕士研究生。主要研究方向：感染免疫。E—mail: 1424r810246@qq. com
中国病原生物学杂志2021年1月第16卷第1期
Journal o f Pathogen Biology Jan. 2021. Vol. 16，No. 1•39 •
内稳态中具有重要作用X。T R I M蛋白可对一些蛋白 进行泛素化等翻译后修饰靶向降解蛋白，限制病毒复 制。T R IM22是从干扰素a/|3刺激的D uadi细胞系 的c D N A中分离出的x，能经干扰素诱导而表达。干 扰素诱导跨膜蛋白（interferon-induced transmembrane proteins, IFITMs )是一 类小分子同源蛋白家族，定位于胞浆和溶酶体内膜，使细胞对多种病毒产生 抵抗力。IF IT M3为广谱性宿主限制性因子，受I型 和n型干扰素高度诱导，对多种病毒都表现出抗病毒活性[「。作者前期研究中.通过GENE-VESTIGA- T O R发现IF IT M3与T R IM22可能具有相互作用。
Foxp3是控制调节性T细胞功能的关键转录因子，在抗原刺激的效应细胞/记忆细胞以及幼稚C D4~ 和C D8‘T细胞中发挥作用x。C D4—FoxP3+ T细胞可以抑制T细胞介导的宿主针对自身和非自身抗原的免疫反应。在感染性疾病中，C D8_ Tr e g细胞会 降低针对病原体的免疫反应，减轻因免疫反应加剧而 引起的组织损伤，其参与的增加可能有助于病原体逃避宿主的免疫反应[6:。
材料与方法
1材料
1.1材料数据库
1.1.1 S T R I N G数据库 S T R I N G数据库（ /)是一个搜索已知的蛋白互作关系的数 据库，用来研究蛋白互作关系并提供蛋白之间联系的 数据与预测的工具[7]。通过在S T R I N G上的分析，得 到与IF I TM3、T R I M22、F O X P3关系邻近的基因及其 之间的关系预测的网络图。
1. 1. 2 D A V I D 数据库 D A V I D(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)是生物信息数据库（v/)整合 了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列 表提供系统综合的生物功能注释信息:8:。通过Gene-M A N I A在线分析后得互作基因的名称列表，并将数 据导人D A V I D数据库进行G O分析。
1.1.3 K O B A S数据库 K O B A S C K E G G Orthology Based Annotation System)是一■个被广泛用于基因/蛋 白质功能注释和功能集富集的网页版数据库（ kobas.cbi.pku.edu)"-，在给定一组基因或蛋白质 后，该数据库可以确定某些通路和基因功能注解是否 有统计学意义。将在G e n e M A N I A数据库得到的基因I D导入K O B A S数据库进行K E G G分析。
1.2 主要试剂和仪器TRlzol试剂购自美国In-vitrogen公司；c D N A逆转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；biosharp红细胞裂解液购自兰杰柯科技有限公司；荧光定量P C R试剂盒（T B Green Premix Ex Taq™II)购自宝生物工程（北京）有限公 司。实时荧光定量P C R中所用的引物由华大基因公司合成。
2研究对象
2019年10月一2019年12月新疆医科大学第一 附属医院住院及门诊患者共60例，其中甲、乙、丙型肝 炎病毒感染患者各20例。健康对照组20例。
乙型肝炎病毒感染患者纳人标准:①年龄>18周 岁；②有乙型肝炎病史或H B s A g阳性>6个月，现 H B s A g和（或）H B V D N A仍为阳性者。排除标准：① 合并其他病毒感染的患者；②患有肿瘤、自生免疫性疾 病；③患有心脑血管疾病丙型肝炎病毒感染患者纳入 标准:①年龄>18周岁；②有丙型肝炎病史或血液抗_ H C V阳性和（或）H C V R N A阳性者。排除标准：① 合并其他病毒感染患者；②患有
肿瘤、自生免疫性疾 病;③患有心脑血管疾病甲型流感病毒感染患者组：纳 人标准:①年龄>3岁；②甲型流感病毒咽拭子核酸检 查阳性。排除标准：①合并其他病毒感染的患者;②患 有肿瘤、自生免疫性疾病;③患有心脑血管疾病健康对 照纳人标准：①年龄>18周岁；②外周血细胞计数、肝 肾功能、X线检查均正常。排除标准：①明显的心、脑 血管疾病;②先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾 病;③近期使用过影响免疫系统的药物。
3方法
3.1标本采集采集受试者外周静脉血2 m l抗凝 管，颠倒混匀，4 °C冰箱保存不超过24 h。
3.2 荧光定量P C R检测目的基因相对表达量
3. 2. 1引物设计与合成按照G e n B a n k中人 T R I M22、IFI TM3、Foxp3、C D4 和 C D8 的基因序列设 计引物.以人G A P D H作为内参基因。引物均由华大 基因公司合成，引物基本信息见表1。
表1引物的基本信息
Table 1Informations of primers
名称核苷酸序列
Name Sequence(5’-3’）
eact
TRIM22
F：GCA CGC TCA T C T CAG ATC TCC
R：T T T TGG C T T C T T CAA T G T CCA G IFITM3
F：CCC ACG TA C TCC AAC T TC CA
R：AGC ACC AG A A A C ACG TGC ACT GAPDH
F：GAG TCA ACG G A T T T G GTC GT
R：GAC A A G C T T CCC G T T CTC AG Foxp3
F：TCC CAG A G T TCC TCC AC A AC
R：A T T GAG TG T CCG CTG CT T CT CD4
F：GCT GGA A TC CAA CA T CAA GG
R：CTG AAA CCG G TG AGG ACA CT
3.2.2外周血白细胞R N A提取按说明书步骤操作，用红细胞裂解液裂解人外周血中的红细胞，从而分
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离并富集血液中的白细胞。按TRIzol—步法提取白 细胞总R N A，并测浓度与纯度后置一80 X：保存。
3.2.3逆转录合成c D N A逆转录按照试剂说明步 骤操作，以总R N A为模板，取1000 n g总R N A用 PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆转录试剂盒合成c D N A。反应体系（20 j n l):5XPrimeScript Buffer 4 j u l,PrimeScript R T Enzyme Mix I1p t l,Oligo dT Primer 1j u l-Random 6 mers1j i l，Total R N A与R N a s e F r e e d F L O共12^1。反转录反应条件：25 C 10 min，42 _C 15 min，85 —C 5 s。产物置一20 'C保存。
3.2. 4 实时荧光定量P C R检测总反应体系（20 pi)：上、下游引物各 0. 8 pi，T B Green Premix Ex Taq™I I试剂 10 f i l,R()X染料 0.4 pl，c D N A 2 pl，补 d d H:0至20 pi。每个样品同一引物设双复孔，试验 扩增均设阴性对照。反应条件：95 X：30 s;95 X： 5 s，60 S C 30 s，共40个循环。P C R产物的相对定量采用相对C t法（2^in)。
3. 3 统计学分析应用GraphPad Prism 8软件进行 统计学处理，数据采用均数士标准差G士s)表示，多组 数据比较采用单因素方差分析（A N O V A)，组间比较 采用L S D分析检验。K E G G生物通路富集分析通过Fisher Exact Test计算P值，以P<0. 05为显著性阈 值;G O生物通路富集分析使用超几何分布方法计算P值.以尸<〇.〇5为差异有统计学意义。
结果
1 STRING基因互作网络图
通过S T R I N G做出与IFITM3、T R I M22 和FoxP3基因邻近的50个基因的相互作用网络图（图1)。这些基因通过物理相互作用、共表达、预测、共定 位、通路、遗传相互作用、共享蛋白结构域等关系相联系。
图1丨FITM3、T R IM22和F oxp3基因邻近的50个基因相互作用网络图
Fig. 1The interaction network of 50 genes adjacent to IFITM3, TRIM22 and Foxp3
2 GO功能注释和通路富集分析
用STRING中得到的基因互作网络图中的约50 个基因进行富集分析，在DAVID数据库中得到GO 分析
结果，在KOBAS数据库中得到K E G G分析结 果。G O分析从分子生物学功能（Molecular Function ，MF) 、生物 学过程 （Biological Process ，BP) 和细胞学组分（Cellular Components，CC) 3个方面预测基 因功能。基因富集分析数据显示，G0:0060337(l型 干扰素信号通路），G O:0051607(病毒防御反应），G(): 0009615C病毒应答反应），G O:0045071(病毒基因组复 制负调控反应），〇():0060333(7干扰素介导的信号通路），G():0034341(对 7 干扰素的反应），GO:0035455 (对a干扰素的反应），G O:0006955(免疫反应），GO: 0045944(RNA聚合酶II启动子转录的正调控），GO: 0045893 (以D N A为模板的转录正调控），GO: 0000975C调控区DNA结合），G():0005515(蛋白质结 合），G():0003700(转录因子活性，序列特异性DNA 结合），GO:00005125(细胞因子活性）等与病毒感染和 免疫相关的细胞学功能。以P<〇. 05为界限从大到小排序，所得到的分别代表BP、CC、MF 3方面的细胞 功能条形图（图2)。
在 KOBAS 数据库中（http ://kobas. cbi.
pku.
中国病原生物学杂志2021年1月第16卷第1期
Journal o f Pathogen Biology Jan. 2021. Vol. 16，No. 1• 41 •
edn /)，用S T R I N G 中得到的互作网络图中约50
个基因进行K E G G 分析，与某种特定病毒感染相关的 通路如表2所75 ；与信号通路相关的通路如表3所水。 可见本研究中的基因相关信号通路与对应基因具有关 联的可信度较高（P <〇. 〇5)。
健康对照者= 2.987.P <0. 01)；甲型流感病毒感染 患者（4.013±0. 881)高于健康对照者G =2. 987.P <0. 01)。乙、丙型肝炎和甲型流感病毒感染患者
T R I M 22的mRNA 相对表达水平略高于健康对照者，
但其差异均无统计学意义（P 〉〇. 〇5);FoxP3的mR-
N A 相对表达水平差异也无统计学意义（P >0. 05)。 Foxp3和CD4的mRN A 相对表达水平差异不具有统
计学意义（P >〇. 05)。将3组患者合为病毒感染组与 健康对照组进行比较.病毒感染患者外周血白细胞中
CD4 的 mRNA ( 0. 5748 ± 0. 2229 )与健康对照者 (1.239±0. 6013)比较，差异具有统计学意义（r =2. 981,P <0. 01)。
对丙型肝炎病毒感染患者、乙型肝炎病毒感染患 者、甲型流感病毒感染患者的IFITM 3、T R I M 22和
Foxp 3的m R N A 相对表达量进行相关性分析。结果
显示，3种病毒感染患者外周血白细胞IF I T M 3和
T R I M 22 m R N A 相对表达呈正相关（r = 0. 3689, f =
0. 0044)(图_3.)；吓1丁1^3 和 Foxp 3 m R N A 相对表达无 显著相关性；Foxp 3和T R I M 22 m R N A 相对表达呈正 相关（r =0. 2807，P =0.0398);Foxp 3 和 C D 4 在 m R -
N 八水平上相对表达呈正相关（r = 0. 4170, P =
0• 0009)(图 4)。
讨论
IF I TM 3是一种具有抗病毒活性的抗病毒因子，
与多种病毒感染相关:1
。也有研究表明，T R I M 22
具有抑制病毒复制的作用m
。F O X P 3，也称为
scurfin ，是一种参与免疫系统反应的蛋白质。F O X P 3
是F 〔)X 蛋白家族的成员，似乎在调节性T 细胞的发 育和功能中充当调节途径的主要调节因子，调节性T 细胞在抑制抗病毒T 细胞免疫应答中发挥重要作 用1n 。为了进一步了解 T R I M 22、IF ITM 3 与 Foxp 3 之间的联系和关系，本研究对此进行了基因相互作用 的生物信息学分析，收集了 3类病毒感染患者的外周 血，提取白细胞进行IF 1T M 3、T R I M 22和Foxp 3的电刷镀溶液
m R N A 的相对表达分析和相关性分析。结果发现. I H T M 3与T R I M 22的表达呈正相关，Foxp 3a 与 T R I M 22的表达呈正相关，C D 4与FoxP 3的表达呈正
相关。
在天然免疫应答中产生的干扰素与相应的干扰素 受体结合.激活Jak -S T A T 信号传导通路。活化的
Jak -S T A T 信号转导通路启动一系列干扰素刺激基因
的表达，而这些干扰素刺激基因的产物是非常重要的 一类抗病毒分子，参与调节机体的免疫功能，并且在抗 病毒感染过程中起着重要作用。I FIT M 3是干扰素刺 激基因（Interferon-stimulated genes ，ISGs )之—-，病毒
信号通路 Signaling pathway 通路代码
ID 基因数Num ber
P T 细胞受体信号通路hsa046608 2. 19E-07J a k -S T A T 信号传导通路hsa046308 2. 75E-06T o ll 样受体信号通路hsa046205 1. 22E-03胞浆D N A 传感途径通路hsa046233 3. 3E-02B 细胞受体信号通路hsa046623 3. 8E-02R IG -I 样受体信号通路
hsa04622
3
3. 9E-02
3乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒感染患者外周血白
细胞中 IFITM3、TRlM22、Foxp3、CU4 和 Cl)8 mRNA 相对表达及丨FITM3、TR1M22和Foxp3相关性分析
q R T -P C R 检测乙型肝炎病毒感染患者外周血白
细胞（4.462±3. 441)中的IF 1T M 3 m R N A .相对表达 水平高于健康对照者（1. 2925±0. 8741)(f = 2. 987，P <〇.〇1)；丙型肝炎病毒感染患者（4. 406±4. 415)高于
图2
iFlTM3、TRlM22和Foxp3关系相邻近的50个基因GO 分析
Fig. 2 GO analysis of 50 genes adjacent to IFITM3, I RIM22 and Fo\p3
表
2 i m ’M3、TRl\122和Foxp3关系相邻近的50个基因KEGG 分析
(病毒感染疾病相关的通路）
Table 2 K F ^G G analysis of 50 genes adjacent to the relationship hetween IFITM3, TRIM22 and P'oxp3 (pathways related to viral
infections and diseases)
病毒感染相关通路
Virus infection related pathways
通路代码
ID 基因数Num ber P 甲型流感
hsa0516414 1. 54E-13单纯疱疹病毒1型感染
hsa0516814 2.97E-13麻疹hsa0516212 5. 67E-12丙型肝炎hsa0516098. 58E-08乙型肝炎
h'sa051617 3. 99E-05H IV 病毒1型感染感染
hsa05166
6
5. 10E-03
表3
与丨FITM3、TR1M22和FOXP3关系相邻近的50个基因KEGG
分析（信号通路相关的通路）
Table 3 KEGG analysis of 50 genes adjacent to the relationship between
IFITM3, IRIM22 and FOXP3 (signaling pathway related
pathways)
• 42 •
中国病原生物学杂志202]年]月第]6卷第】期
jo u rn a l o f Pathogen Biology J a n.2021 . V o l.16.N o.1在本研究中病毒感染患者的IFITM3与TRIM22(A)IF1TM3与Foxp3(B)TR丨M22与Foxp3(C)mRNA
Correlation analysis of IFITM3 and TRIM22(A) IFITM3 and Foxp3(B) TRIM22 and Foxp3(C) mRN
in patients infected >vith virus in this study
Foxp3的mRNA相对表达水平Foxp3的mRNA相对表达水T
图4病毒感染患者的Foxp3与CD4相对表达水平相关性分析
Fig. 4 Correlation analysis of relative expression levels of F«\p3 and CI)4 in patients with viral infection in this study
感染机体后.I F N s分泌增加并激活Jak-S T A T通路诱 导ISGs的转录:1S。ISG15参与干扰素刺激基因的抗 病毒机制，在经I F N诱导后与多种细胞蛋白共价连接，对不同细胞的生命活动进程产生调节:l n:。Barr 等：研究表明T R I M22和ISG15的作用途径相同，T R I M22可作为1S G15的E3连接酶而存在。IF-IT M3蛋白上具有棕榈酰化、泛素化及磷酸化位点以 调节该蛋白的表达、定位，这些修饰位点也与抗病毒活 性有关:11:.作为E3泛素连接酶的T R1M22可能在 IF IT M3蛋白的泛素化中起到作用•有待于进一步的 实验验证。
病毒感染宿主后，衍主的天然免疫系统是抵御病毒人侵的首道防线，它被立即激活并启动相应的免疫应答机制。天然免疫应答的激活首先主要通过宿主模 式识别受体（Pattern recognition receptors,P R
R s)对 病原相关模式分子（Pathogen-associated molecular pattems.P A M P)进行特异性识别11。细胞膜结合P P R s包括Toll样受体和C凝集素受体.细胞核结合 P P R s包括R IG-】样受体和N O D样受体。当宿主被 R N A病毒感染后，病毒核酸会被T L R3所识别•活化 转录因子 IRF3 (IFN regulatory factor 3，IRF3 )，启动 干扰素的表达.进而激活干扰素介导的天然免疫应答 抵抗病毒的感染22:。还有研究显示，在病毒感染后，IFITM3受I型干扰素诱导表达增加.并通过增强细胞内自噬和诱导IRF3向自噬体迁移而促进IRF3的降解，进而负调控RI.R s介导的I型干扰素产生的号通路 •而在T R I M家族中.T R I M22是由干扰素 诱导后表达最强烈的分子1.I H T M3对R L R s介导 的I型干扰素产生的信号通路的负调控可能会对T R I M22的表达产生间接影响。
F()X P3的翻译后修饰对转录因子的稳定性和功能有重要影响。E3泛素连接酶S T U B1作为n)X P3 负调控因子，S T U B1在体内与F O X P3相互作用. S T U B1的过表达诱导泛素介导的F O X P3降解:'。E3泛素连接酶T R A F6可使Fox P3发生k63泛素化 修饰，在缺乏T R A F6活性或泛素化位点突变的情况下，F O X P3的表达和调节功能都产生异常，T R A F6与K63连锁的泛素化确保F O X P3正常表达，并促进 Tregs中转录因子的基因调节活性“。本研究中，3种病毒感染患者的外周血白细胞的n)X P3和T R I M22m R N A相对表达正相关。泛素依赖途径能够控制H)X P3的激活和表达以及Tregs的功能7，同样作为E3泛素连接酶的T R1M22可能诱导F O X P3的泛素化，有待于进一步研究。
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duced factor that represses human immunodeficiency virus type I
相对表达水平相关性分析
A relative expression levels
图3 Fig. 3
r=0.2807
p=0.0398
¥
IF IT M3的m R N A相对表达水平旧丁\13的〇11^八相对表达水甲
B
Foxp3的mRN A相对表达水平
I
-
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1
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1
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功率谱密度
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惊弓之鸟教学实录-
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-准分子激光
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