中国兽医科学 2021，51(01):24-30
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-ll-10
DOI: 10.16656/j.issn.l673-4696.2021.0003 中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1673-4696(2021)01-0024-07
建立与应用
杨发龙，刀筱芳，张斯旃，张煥容*
(西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都610041)
摘要：为同时检测伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌3种引起山羊皮下脓肿的主要病 原菌，选择针对这3种病原的特异性引物，经条件优化后建立一种可同时检测以上3种病原菌的三重PCR 方法，评价了该方法的特异性和敏感性，并检测了临床样品。结果显示，所建立的三重PC R方法仅对伪结核 棒状杆菌、金黄葡萄球菌及化脓隐秘杆菌这3种目的病原菌DNA产生阳性扩增，对大肠杆菌等其他9种微生物的DNA扩增结果均为阴性，具有较强的特异性。该方法同时显示较高的敏感性，对伪结核棒状 杆菌、金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌基因组DNA的检测下限分别为1.0X103、1.1X103和6.7X102copies；对3 种病原菌菌液的检测下限分别为8.7 X102、1.1X1〇2和5.1X102C F U/mL。该方法能从临床样品中检测到相 应病原，其结果与单一 P C R方法一致。本研究中建立了同时检测山羊皮下脓肿主要病原菌的特异和灵敏的 三重P C R方法，为该病的快速诊断提供了有用的技术手段。
关键词：皮下脓肿；伪结核棒状杆菌；金黄葡萄球菌；化脓隐秘杆菌；三重PCR
Establishment and application of a triplex PCR for detection of
pathogens causing goat subcutaneous abscess
YANG Fa-long,DAO Xiao-fang,ZHANG Si-qi,ZHANG Huan-rong*
{Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization .Southwest Minzu
University,Chengdu610041, China)
Abstract：The objective of this study was to establish a triplex PCR method for simultaneous detection of Corynebacterium pseudotuberculosis,Staphylococcus aureus and Arcanobacterium pyoge
nes that are the main pathogens causing goat subcutaneous abscess. Three pairs of pathogen-specif ic primers reported in the literatures were analyzed and selected to establish the triplex PCR method by optimizing the annealing temperature and primer concentration. Subsequently,the specificity and sensitivity of the triplex PCR method were analyzed and validated by detection of clinical samples. The results showed that the established triplex PCR method presented good specificity and sensitivity for detection of C.pseudotuberculosis,S. aureus and A.pyogenes.The detection limits for genomic DNA of C. pseudotuberculosis,S. aureus and A.pyogenes were 1.0 X103,1. 1X103and 6.7 X102copies Respectively. The detection limits for bacteria loading were 8.7X102,1. 1X102and 5. 1X l〇2CFU/mL,respectively. The method could successfully detect the corresponding pathogen from the clinical samples,and the results were consistent with the single PCR test results. This study developed a triplex PCR which could simultaneously detect three subcutaneous abscess-causing pathogens,and therefore provided a rapid and
收稿日期：2020-07-04；修回日期：2020-10-31
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（2018NZD12)
作者简介：杨发龙（1976-)，男，青海大通人，博士，研究方向为动物病原生物学。*通信作者：张焕容（1969-)，女，教授，研究方向为动物传染病防治，E-mail: ****************。
第1期杨发龙等：山羊皮下脓肿病原菌■：重P C R检测方法的建立与应用25
accurate method for the diagnosis of subcutaneous abscesses in goats.
Key words：subcutaneous abscess；Corynebacterium pseudotuberculosis；Staphylococcus aureus；Arcanobacterium pyogenes；triplex PCR
* Corresponding author：ZHANG Huan-rong,E-mail ：zhrong05@163. com
山羊皮下脓肿又称体表淋巴结炎、干酪性淋巴 结炎，是一种山羊常见和多发性疾病。该病主要表 现为患羊皮下组织或浅表淋巴结肿大，化脓形成脓 腔，精神沉郁，食欲下降和日渐消瘦[1]。虽然其致死 率相对较低，但往往因未得到足够的重视而导致该 病广泛传播且难以清除，严重影响山羊的生产性能 和皮张质量，以及屠宰时造成胴体损失，给山羊养 殖业带来很大的经济损失[2]。
引起皮下脓肿的病因较为复杂，但病原微生物 感染是最为主要的病因。国内外的研究表明，感染 并导致山羊皮下脓肿的最常见病原为伪结核棒状 杆菌、金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌[u_5]。例如，我国庞仕龙等[61早在1996年首次证实伪结核棒状 杆菌是干酪性淋巴结炎的病原。李乡城"]在2016年 对四川主要养羊地区的山羊皮下脓肿进行了病原 学调查，发现除伪结核棒状杆菌外，金黄葡萄球 菌也是重要的病原之一。而许国洋等ffi2017年对重 庆地区山羊淋巴结炎病原菌进行了分离鉴定，证实 伪
结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌及化脓隐秘杆菌 是最主要的病原菌，并建立了检测山羊淋巴结炎病 原菌的多重P C R方法。笔者所在课题组对四川省多 个地区引起山羊皮下脓肿的病原进行了鉴定，结果 同样表明伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌及化脓 隐秘杆菌是3种最为主要的病原[7]。上述病原引起 的皮下脓肿在临床表现上十分相似，且常混合感染，为该病的诊断和带来困难[1〜。
目前，国内外对于山羊皮下脓肿的诊断和病原 检测方法包括传统的病原分离鉴定、血清学方法[9"n]和PC R方法[12_15]等。其中，传统的病原分离培养耗 时费力，且由于涉及多种病原混合感染等情况而容 易造成漏检[5，16]，而血清学方法仅间接表明感染状 况，不能作为诊断的直接证据。PC R方法具有敏感、特异和快速的特点，并且在无须分离病原的情况下 直接从临床样品中对病原核酸进行检测。国内外针 对上述常见的引起山羊皮下脓肿的病原，均已建立 了各自的特异性PC R方法。然而，在临床上，如果对 不同病原逐一检测，仍需耗费较多检测试剂，以及 时间和精力。因此，为从临床样品中快速检测引起 山羊皮下脓肿的病原，本研究建立了一种能同时检 测伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌及化脓隐秘杆菌的三重P C R方法，旨在为该病的快速诊断、病原 检测及流行病学调查提供有用的技术手段。
1材料与方法香港轻轨
1.1主要试剂
琼脂糖购自英国OXOID公司。蛋白酶K购自美 国Sigma公司。DL2000 DNA Marker购自宝生物工程 (大连）有限公司。2 X Taq PC R预混试剂II (KT211)和GoldviewII均购自天根生化科技有限公司。胰蛋 白胨大豆琼脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)均 购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2菌株、临床样品及核酸提取
伪结核棒状杆菌（ATCC19420)、化脓隐秘杆菌 (ATCC49698)、金黄葡萄球菌(ATCC25923)参考菌 株及临床分离株和链球菌（SUWN201)、沙门菌(SW U N202)、大肠杆菌(SW U N203)、粪肠球菌(SW U N204)、假单胞菌（SWUN205)、莫拉菌（SWUN206)、放线菌 (SWUN207)、溶血性曼氏杆菌（ATCC31611)、布鲁 菌（S2)均由西南民族大学动物医学实验室保存。60 份山羊皮下脓肿脓液样品采自四川省简阳市、乐至 县、金堂县、蓬溪县、大英县的5个山羊养殖场。采 用酚氯仿法提取各菌株基因组D N A和临床样品 DNA0
1.3引物的设计与合成
选择文献报道的分别针对伪结核棒状杆菌16S rRNA基因、金黄葡萄球菌m jc基因、化脓隐秘杆 菌16SrRNA基因的特异性引物作为三重P C R引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体 引物信息见表1。
1.4三重PCR退火温度的优化
参考各对引物的退火温度，在51〜59 °C范围 内设定5个梯度。反应体系为25 n L：预混酶（2X TaqPCR预混试剂II )12.5 m L，上游和下游引物（10 pmol/F L)各0.5 m L，3种模板DNA等体积混合物3 ML，其余用无菌去离子水补齐。反应条件:95 °C5min;
94 °C 30 s，51 〜59 °C 30 s，72 °C30 s，共 35 个循环；
72 °C 5 min，结束反应。P C R产物经电泳后观察结 果。根据反应产物的电泳条带亮度高、引物二聚体 少以及无非特异性扩增条带为标准确定最佳退火 温度。
26中国兽医科学第51卷
表1引物信息
Table 1Primers used in this study磁流
病原名称引物名称序列（5'—3。产物大小/bp文献来源Pathogens Primer name Sequence Product size References
伪结核棒状杆菌CP 167ACCGCCATTAGTGTGTGTG
816[17]
C.pseudotuberculosis CP982TCTCTACGCGATTCTTGTAT
金黄葡萄球菌SAU327GGACGACATTAGACGAATCA
1 318[18]
S.aureus SAU1645CGGGCACCTATTTTCTATCT
化脓隐秘杆菌PL0-657F AGCGTAGATACACCGACA
657[19]
A. pyogenes PL0-657R GTTTGCTGGAAGTTGAATAG
1.S引物浓度的优化
在确定最佳退火温度的基础上，采用正交设计, 分别设定1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 fxmol/L的各引物 终浓度，利用不同浓度引物的组合进行三重P C R扩 增。P C R产物经电泳后观察，以条带明显且亮度高、引物二聚体少及无非特异性扩增条带为标准，确定 最佳引物浓度。
1.6三重PC R的特异性试验以酚氯仿法提取各稀释度菌液DNA，将每个稀释度 DNA等量混合后作为模
板，以上述优化好的体系和 条件进行三重PC R检测，混合模板加人量为3 m U 同时，对上述不同稀释度的DNA溶液用3种病原 各自特异性的单一 P C R进行检测，单一 P C R模板 加人量为1ML。比较三重及单一 P C R的敏感性。
1.8三重PCR的应用
为评价本研究中所建立的三重P C R对山羊皮
以优化好的P C R反应条件，以伪结核棒状杆 菌、化脓隐秘杆菌、金黄葡萄球菌参考菌株和分 离菌株以及链球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门菌、大肠 杆菌、粪肠球菌、假单胞菌、莫拉菌、放线菌和布鲁 菌DNA为模板进行三重P C R扩增检测，产物经电 泳后观察结果。
1.7三重PC R的敏感性评价
1.7.1 三重P C R对细菌基因组DNA检测的敏感性 试验为评价该三重PC R对各病原基因组DNA检 测的敏感性，从伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和 金黄葡萄球菌培养物中提取基因组DNA，用核酸 蛋白检测仪测定各病原基因组DNA浓度，并根据 各病原基因组大小，利用在线工具（cels.uri. edu/gsc/cndna.html)计算拷贝数。随后，用去离子水 对各病原基因组DNA进行10倍系列稀释。然后，将各稀释度的3种病原的基因组DNA分别等量混 合后作为模板。以上述优化好的体系和条件进行三 重
P C R检测，混合模板加人量为3y L。同时，采用 与多重P C R相同的引物对上述不同稀释度的DNA 溶液进行单一 P C R检测，单一 P C R模板加人量为 1ML。比较三重及单一 P C R的敏感性。
1.7.2 三重P C R对菌体数量检测的敏感性试验
为评价该三重P C R对各病原菌菌体数量检测的敏 感性，分别将伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌、化 脓隐秘杆菌接种于加有50 mL/L马血清的T S B培 养基,37 °C培养20 h。用T S B培养基将各细菌菌液 10倍系列稀释并以平板计数法计算菌液浓度，同时下脓肿临床样品中各病原检测的可行性和可靠性，取无菌采集的60份脓液样品各200 h L，采用酚氯仿 法提取总DNA作为模板，利用建立的三重P C R方 法进行检测，同时采用与多重P C R相同的引物进行 单一 PC R检测，比较单一 P C R与三重P C R的检测 结果。同时，为了评价所建立方法检测结果的可重 复性，对所有临床样品用三重PC R再次进行重复检 测，对2次检测结果进行比较。帅府家风
2结果
2.1三重PCR退火温度的优化
为获得该三重P C R扩增的最适退火温度，设置 5个梯度的退火温度进行扩增。结果（见图1)显示，当退火温度为55 °C时，三重PC R扩增出的所有基 因片段条带清晰、亮度高、无非特异性扩增。
M1 2 3 4 5 6
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
图1三重PC R退火温度的优化
Figure 1Annealing temperature optimization of triplex PCR M:D N A分子质量标准；1〜5：退火温度分别为51、53、55、57、59 X：; 6：无模板对照。
M：DL2000 D N A Marker ；1—5：Annealing temperature 51 °C ,53 °C ,55 °C ,57 "C and 59 °C .respectively ；6：N o template
control.
第1期杨发龙等：山羊皮下脓肿病原菌三重P C R检测方法的建立与应用27
2.2引物终浓度的优化
通过正交试验，对不同浓度的3对引物进行组 合并分别进行PCR，从而确定最佳终浓度。结果显 示，扩增伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌、化脓隐 秘杆菌的3对引物的最佳终浓度分别为0.6、1.0、0.6
pmol/L。2.3三重PCR的特异性试验
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使用上述优化后的反应体系和条件，以不同病 原的DNA为模板进行三重P C R检测。结果显示，该 三重P C R仅对伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌及金 黄葡萄球菌DNA有特异性扩增，产物大小与预期 相符，而对其他9种病原的DNA则均无扩增（见图 2)，表明该方法的特异性强。
2 000 bp
酷溜1000 bp
750 bp
500 lip
250 bp
100 bp
图2三重P C R的特异性试验
Figure 2 Specificity test of the triplex PCR
M:D N A分子质量标准；1〜12：分别为伪结核棒状杆菌、化脉■隐秘杆菌、金黄葡萄球菌、链球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门菌、大肠杆菌、粪肠球 菌、假单胞菌、莫拉菌、放线菌、布鲁菌基因组D N A;13：无模板对照。
M：D L2000D N A Marker；1一12：Genomic D N A from C. pseudotuberculosis,A. pyogenestS. aureus,Streptococcus,M. haemolytica,Salmonella,E. coli, E. faecalis, Pseudomonas, Moraxella, Actinomycetes, Brucella,respectively ；13 ：N o template control.
2.4三重PC R的敏感性试验
2.4.1 三重P C R对基因组DNA的敏感性试验为评价该三重PC R方法对各病原基因组DNA检测的 敏感性，对3种病原的基因组DNA进行梯度稀释并 等量混合后作为模板，分别用三重P C R和各病原单 一 PC R进行扩增。结果显示，三重PC R方法对伪结 核棒状杆菌、金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌基因 组D N A的检测下限分别为1.0X103、1.1 X103和6.7X102copies。与单一 P C R相比，对伪结核棒状杆 菌基因组D N A的检测敏感性低1个数量级，而对 金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌基因组DNA的检 测敏感性相同（见图3)。
2.4.2 三重P C R检测菌体数量的敏感性试验为评价该三重P C R方法检测各病原菌菌体数量的敏 感性，对10倍系列稀释的菌液分别提取DNA并等 量混合后作为模板进行三重PC R扩增。结果显示，三
重P C R方法对伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球 菌和化脓隐秘杆菌的最低检测浓度为8.7X102、1.1父102和5.1父1〇2〇尸1]/11^，与单一？0^检测的敏感度均相同（见图4)。上述结果表明，三重PCR 对纯化的3种细菌体的检测敏感性与单一 P C R的一致。2.S三重PCR对临床样品的检测
对从临床采集的60份山羊皮下脓肿脓液样品 中提取的总DNA经所建立的三重P C R和单一 PCR 方法分别检测。结果显示，三重P C R方法对伪结核 棒状杆菌的检出率为51.6%(31/60)，金黄葡萄球 菌的检出率为41.6%(25/60)，化脓隐秘杆菌的检出 率为5.0%(3/60)，对所有样品采用三重P C R进行2 次重复检测，结果相同，表明所建立的三重P C R稳 定性好。三重P C R与单一 P C R对所有样品的检测 结果完全一致，即所有被单一 P C R检测为阳性的样 品，三重P C R检测也为阳性。这表明，所建立的三重 P C R能特异、敏感地对临床样品进行检测。此外，从 对每只患病山羊感染的病原种类统计结果发现，3 份样本中存在金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌的 混合感染，即所有检测到化脓隐秘杆菌的3份样本 中均检测到金黄葡萄球菌。其余所有样本均只检 测到伪结核棒状杆菌或金黄葡萄球菌。
3讨论
目前，国内外学者已分别针对伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌和化脓隐秘杆菌3种引起山羊皮 下脓肿的病原建立了特异性常规P C R
及荧光定量
28中国兽医科学第51卷
2 000 bp
1000 bp 750 bp 500 bp 1000 bp 750 bp 2 000 bp
1000 bp 750 bp
500 bp M12 3 4 5 6 7
Triplex PCR
C. pseudotuberculosis
single PCR
S. aureus
single PCR
A. pyogenes
singie PCR
图3三重PC R对3种病原基因组D N A检测的敏感性试验
Figure 3 Detection limits of the triplex PCR for genomic DNA from 3 pathogens
M:D N A分子质量标准；l〜6:10倍系列稀释的伪结核棒状杆菌D N A(1.0X107〜1.0X102c o p i e s/>L)、金黄葡萄球菌D N A(l.l X106〜l.lX H V c o p i e s/p L)和化脓隐秘杆菌 D N A(6.7X 105〜6.7X100copies//iL);7：无模板对照
M：D L2000D N A M a r k e r；1—6：l〇-fold serial dilution of C. pseudotuberculosis D N A (1.0X l〇7to 1.0 X l〇2copies/^L) ,S. aureus(1.1 X 106to 1.1 X 101copies/^L) and A. pyogenes(6.7X l〇5 to 6.7 X 10° copies//^L) ；7 ：N o template control.
M 2 3 4 5 6
2 000 bp中国扬州寄语市长
1000 bp 750 hp 500 bp 1 000 bp 750 bp
2 000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp Triplex PCR
C. pseudotuberrulosis single PCR
S. aureus
single PCR
A. pyogenes
single PCR
图4三重PC R对不同菌体数量的敏感性
Figure 4 Detection limit of the triplex PCR for bacterial loading
!^:〇\1八分子质量标准；1〜7:10倍系列稀释的伪结核棒状杆菌(8.7\107〜8.7父101〇卩1；/111匕)、金黄葡萄球菌（1.1\107〜1.12\101〇卩1]/111匕)、化脓隐秘杆菌(5.1X107〜5.1X101 C F U/m L);8：无模板对照
M：D L2000D N A M a r k e r；1—7：l〇-fold dilutions of C. pseudotuberculosis{8.7X107to 8.7X 101C F U/m L),S. aureus(l.l X107to 1.12X 101 C F U/m L) and A. pyogenes(5.1 X107 to 5.1 X101 C F U/m L)；8：N o template control.
P C R检测方法;1245>21;。但对多种病原逐一检测将消 耗更多试剂，且耗时费力。因此，本研究中建立了一 种能同时检测引起山羊皮下脓肿的3种病原的三 重PC R方法。2017年，许国洋等5报道一种可同时 检测伪结核棒状杆菌、金黄葡萄球菌、化脓隐秘杆菌的三重PC R检测方法。然而，本实验室对该方 法进行验证时发现，其所设计的化脓隐秘杆菌引物 对伪结核棒状杆菌DNA也有扩增，生物信息学分析 也发现该方法中针对化脓隐秘杆菌的引物与伪结 核棒状杆菌的基因组DNA高度同源。因此，
对该三
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