云南农业大学学报 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１１，２６（１）：３４－４０ｈｔｔｐ：／／ｘｂ ｙｎａｕ ｅｄｕ ｃｎＩＳＳＮ１００４－３９０Ｘ；ＣＯＤＥＮＹＮＤＸＡＸＥ ｍａｉｌ：ｘｂ＠ｙｎａｕ ｅｄｕ ｃｎ
ＤＯＩ：１０ ３９６９／ｊ ｉｓｓｎ １００４－３９０Ｘ（ｎ） ２０１１ ０１ ００７
震撼一条龙
祁 宏１，李卫真１，袁 峰１，李大林２，刘丽仙３，钱 坤４，苗永旺１ （１．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１；２．云南省家畜改良工作站，云南昆明６５００２１；
３．云南农业职业技术学院畜牧兽医系，云南昆明６５０２１２；４．湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州３１３０００）
摘要：本文通过ＰＣＲ产物直接测序法得到水牛β－ＬＧ基因第３，４外显子及其旁侧序列后，采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对属于１０个体的２２４头水牛该基因第４外显子进行了多态性检测，又从中随机抽取属于９个体的６９头水牛采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结合测序的方法检测了其第３外显子的遗传多态性。结果显示：河流型水牛和沼泽型水牛β－ＬＧ基因的第３外显子均为７４ｂｐ；它们的第４外显子均为１１１ｂｐ；在所研究体中，两类水牛第３，４外显子序列完全相同，并未发 现具有多态现象。与牛科物种同源序列比较显示：水牛β－ＬＧ基因３，４外显子在进化上比较保守，相应于普通牛的Ｂ等位基因。由于产奶量有明显差异的河流型水牛与沼泽型水牛的β－ＬＧ基因第３，４外显子序列间无差异，提示它们对水牛产奶量无直接影响。
关键词：河流型水牛；沼泽型水牛；β－ＬＧ基因；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ；ＰＣＲ－ＳＳＣＰ
中图分类号：Ｓ８２３ ８３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－３９０Ｘ（２０１１）０１－００３４－０７
ＧｅｎｅｔｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅＥｘｏｎ３ａｎｄ４ｏｆβ－ＬＧｉｎＢｕｆｆａｌｏ
ＱＩＨｏｎｇ１，ＬＩＷｅｉ ｚｈｅｎ１，ＹＵＡＮＦｅｎｇ１，ＬＩＤａ ｌｉｎ２，
ＬＩＵＬｉ ｘｉａｎ３，ＱＩＡＮＫｕｎ４，ＭＩＡＯＹｏｎｇ ｗａｎｇ１
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｏｍｅｓｔｉｃＡｎｉｍａｌＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＣｒｏｓｓｂｒｅｅｄ ｉｍｐｒｏｖｅ
ｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００２１，Ｃｈｉｎａ；引物设计
３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｏｃａｔｉｏｎａｌＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２１２，Ｃｈｉｎａ；４．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕｚｈｏｕＮｏｒｍａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕｚｈｏｕ３１３０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４ｐｌｕｓｔｈｅｉｒｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆβ－ＬＧｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｉｎｂｕｆｆａｌｏｆｉｒｓｔｌｙ．Ｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｏｆｅｘｏｎ４ｏｆβ－ＬＧｉｎ２２４ｂｕｆｆａｌｏｅｓｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏ１０ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆＰＣＲ－ＲＦＬＰａｎｄＰＣＲ－ＳＳＣＰ．Ｔｈｅｎｗｅｓｅｌｅｃｔｅｄｒａｎｄｏｍｌｙ６９ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｆｒｏｍｔｈｅ２２４ｂｕｆｆａｌｏｅｓｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｉｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｏｆｅｘｏｎ３ｏｆβ－ＬＧｂｙＰＣＲ－ＳＳＣＰａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４ｏｆβ－ＬＧｉｎｂｏｔｈｒｉｖｅｒａｎｄｓｗａｍｐｂｕ
ｆｆａｌｏｗｅｒｅ７４ｂｐａｎｄ１１１ｂｐｌｏｎｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４ｏｆβ－ＬＧｈａｄ１００％ｉｄｅｎｔｉｔｙａｎｄｍｏｎｏｍｏｒｐｈｉｓｍｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒｔｈｅｂｕｆｆａｌｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｏｍｏｌｏ ｇｏｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｂｏｖｉｎｅｓｐｅｃｉｅｓ，ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４ｏｆβ－ＬＧａｒｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｂｕｆｆａｌｏｉｓｔｈｅｓａｍｅｗｉｔｈｔｈｏｓｅｃｏｄｉｎｇｂｙＢａｌｌｅｌｅｉｎＢｏｓｔａｕｒｕｓ．Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４ｏｆβ－ＬＧｂｅｔｗｅｅｎｂｏｔｈｋｉｎｄｏｆｂｕｆｆａｌｏ，ｂｕｔｔｈｅｙｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｍｉｌｋｉｎｇｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ｔｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｔｈｅｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４ｏｆβ－ＬＧｈａｖｅ
收稿日期：２０１０－０７－１２ 修回日期：２０１０－０９－０１
基金项目：云南省应用基础研究重点项目（２００７Ｃ０００３Ｚ）；国家自然科学基金项目（３０６６００２４）；云南省应用基础研究计划面上项目（２００６Ｃ００３４Ｍ，２００７Ｃ０５７Ｍ，２０１０ＺＣ２４３）；国家高技术研究发展计划（“８６３”计
划）项目（２００８ＡＡ１０１００１）；云南省教育厅科学研究基金项目（０９Ｃ０１９７，２０１０Ｙ３４４）。
作者简介：祁宏（１９８４－），男，山西原平人，硕士，主要从事动物分子遗传研究。
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：苗永旺（１９６４－），男，博士，教授，内蒙古通辽市人，主要从事动物遗传学研究。Ｅ ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｗａｎｇｍｉａｏ９９９＠ｙａｈｏｏ ｃｏｍ ｃｎ
ｎｏｄｉｒｅｃｔｅｆｆｅｃｔｏｎｍｉｌｋｙｉｅｌｄｉｎｂｕｆｆａｌｏ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｉｖｅｒｂｕｆｆａｌｏ；ｓｗａｍｐｂｕｆｆａｌｏ；β－ＬＧ；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ；ＰＣＲ－ＳＳＣＰ
β乳球蛋白（Ｂｅｔａ－ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，β－ＬＧ）是反刍动物乳汁中乳蛋白的主要成分之一［１］。在普通牛（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ）中，β－ＬＧ基因位于１１号染体，从转录起始位点算起全长４７２４ｂｐ，由７个外显子和６个内含子构成。其开放阅读框包含５３７个核苷酸，共编码１７８个氨基酸，其中前１６个氨基酸为信号肽［２－３］。牛属动物的β－ＬＧ共发现有１１种变异体，其中Ａ和Ｂ是最主要的两种［４］，它们在第６４和１１８位氨基酸有差异，Ｂ变
异体的两位点分别为Ｇｌｙ和Ａｌａ，而Ａ变异体为Ａｓｐ和Ｖａｌ，相应的密码子替换分别为ＧＧＴ→ＧＡＴ和ＧＣＣ→ＧＴＣ［５］。导致这两处碱基替换的位点分别位于β－ＬＧ基因的第３和４外显子。以往的研究主要针对这两个外显子的变异进行分析，结果揭示该基因不同类型对奶酪生产有影响，即ＢＢ型奶牛的牛乳更适合于奶酪生产［６－８］。而β－ＬＧ对其它泌乳性状的影响，研究结果却并不一致，ＢＡＤＯＬＡ等［９］研究表明β－ＬＧ对产奶量有影响，但王强等［１０］认为β－ＬＧ对产奶量无显著影响；ＢＡＤＯＬＡ等研究认为β－ＬＧ对乳脂率无显著影响［１１］，而祝梅香等发现β－ＬＧＢ基因与高乳脂率相关［１２］。
家养水牛分为２个类型：河流型水牛和沼泽型水牛。前者主要为奶用，其产奶量一般在２０００ｋｇ左右。后者主要为役用，其泌乳量一般仅５００～６００ｋｇ［１３］。近年在云南省槟榔江流域发现的我国第一个本地河流型水牛体———槟榔江水牛也具有较高的产奶量［１３］。目前，有关水牛泌乳性状相关基因的研究资料十分匮乏。β－ＬＧ基因是反刍动物乳汁中乳蛋白成分的重要编码基因，该基因在普通牛中研究较多，但在水牛中研究甚少，仅限于在河流型水牛中采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法进行基因分型［１４］和对其第４外显子部分序列进行测序研究［１５］；该基因在沼泽型水牛中的研究尚未见报道。为了揭示河流型和沼泽型水牛β－ＬＧ基因差异及该基因第３，４外显子的体遗传变异，进一步推测该基因与泌乳性状的关系及揭示包括槟榔江水牛在内的我国地方水牛体种质基因特性，本研究采用ＰＣＲ产物直接测序法对产奶性能具有较大差异的河流型和沼泽型水牛β
－ＬＧ基因第３，４外显子进行了序列测定和同源序列比较分析，在此基础上，采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法结合ＤＮＡ测序技术对两类水牛多个体的β－ＬＧ基因第３，４外显子进行了体变异检测分析。
１ 材料与方法
１ １ 材料
本研究所用的各地方水牛样品来自各水牛产区，引进的河流型摩拉水牛和尼里－拉菲水牛样品采自云南省家畜冷冻精液站，个体间避免存在血缘关系，采集每个个体的血液或耳组织样品，带回实验室低温保存。样品详细信息见表１。
１ ２ 基因组ＤＮＡ提取
采用酚／氯仿法提取基因组ＤＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其纯度和浓度，ＴＥ缓冲液稀释为５０ｎｇ／μＬ，保存于４℃。
１ ３ 引物设计与ＰＣＲ扩增及测序
根据已发表的普通牛（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＤＱ４８９３１９），山羊（ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｚ
３３８８１）和绵羊（ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｘ１２８１７）β－ＬＧ基因的全序列，设计４对引物（见表２），分别对水牛β－ＬＧ基因的第３，４外显子进行克隆和多态性检测。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
ＰＣＲ扩增反应体系：１０×ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）２ ５μＬ，ＤＭＳＯ１ ２５μＬ，上下游引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）各０ ４μＬ，ｄＮＴＰｓ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）０ ２μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０ ３μＬ，模板ＤＮＡ２μＬ，ｄｄＨ
２
Ｏ补至２５μＬ。反应程序：９５℃预变性５ｍｉｎ→３５个循环（９４℃变性４０ｓ→退火温度退火４０ｓ→７２℃延伸４５ｓ）→７２℃后延伸５ｍｉｎ。退火温度依引物而异（见表２）。为减少引物二聚体和增加目的产物，第４外显子的两对引物采用降落ＰＣＲ进行扩增。６５→５６表示前１０个循环中每个循环退火温度降低１℃，在５６℃下完成剩余２５个循环；６４／５８表示前１０个循环的退火温度为６４℃，后２５个循环的退火温度为５８℃。反应产物以１ ５％琼脂糖凝胶电泳检测。
５
３
第１期 祁 宏，等：水牛β－ＬＧ基因３，４外显子遗传特征分析
表１ β－ＬＧ基因第３、４外显子检测样品信息
Ｔａｂ １ Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｂｕｆｆａｌｏｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆβ－ＬＧｅｘｏｎ３ａｎｄｅｘｏｎ４
类型ｔｙｐｅ体类别
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
外显子３样品数量
ｓａｍｐｌｅｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｅｘｏｎ３
外显子４样品数量
ｓａｍｐｌｅｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｅｘｏｎ４
采样地
ｓａｍｐｌｅｏｒｉｇｉｎ
河流型ｒｉｖｅｒ摩拉
Ｍｕｒｒａｈ
５５
云南省家畜冷冻精液站
Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ
尼里拉菲
Ｎｉｌｉ－Ｒａｖｉ
６８
云南省家畜冷冻精液站
Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ
槟榔江
Ｂｉｎｌａｎｇｊｉａｎｇ
１１８８
云南省腾冲县
Ｔｅｎｇｃｈｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ
沼泽型ｓｗａｍｐ富钟
Ｆｕｚｈｏｎｇ
６２３
广西省富川县
Ｆｕｃｈｕａｎ，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ滇东南
Ｄｉａｎｄｏｎｇｎａｎ
８１９
云南省广南县
Ｇｕａｎｇｎａｎ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ福安
Ｆｕａｎ
９１９
福建省福安市
Ｆｕ ａｎ，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ
盐津
Ｙａｎｊｉｎ
１１２５
云南省盐津县
Ｙａｎｊｉｎ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ
东流
Ｄｏｎｇｌｉｕ
１０１５
安徽省东至县
Ｄｏｎｇｚｈｉ，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
德宏
Ｄｅｈｏｎｇ
－１７
云南省德宏州
Ｄｅｈｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ德昌
Ｄｅｃｈａｎｇ
３５
四川省凉山州
Ｌｉａｎｇｓｈａｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ
表２ β－ＬＧ基因研究中所采用的ＰＣＲ引物的信息
Ｔａｂ ２ ＴｈｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＰＣＲｓｕｍｍａｒｙ
引物名称ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列（５′－３′）
ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
产物长度／ｂｐ
ｐｒｏｄｕｃｔｓｌｅｎｇｔｈ
退火温度／
℃Ｔ
ｍ
用途
ｐｕｒｐｏｓｅ
Ｅｘｏｎ３－ＵＥｘｏｎ３－ＬＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＧ
ＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＣＧＧＴＴＡＣ
７３６６５
第３外显子测序
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｆｏｒｅｘｏｎ３
Ｅｘｏｎ４－ＵＥｘｏｎ４－ＬＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＡＣＴＣ
ＣＣＣＧＧＴＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡ
７３９６５→５６
第４外显子测序
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｆｏｒｅｘｏｎ４
Ｅｘｏｎ３－Ｓ－ＵＥｘｏｎ３－Ｓ－ＬＣＣＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＴ
ＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡ
３５７５８ ５
第３外显子多态性检测
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｘｏｎ３ｂｙＳＳＣＰ
Ｅｘｏｎ４－ＳＲ－ＵＥｘｏｎ４－ＳＲ－ＬＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＴ
ＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＣＡＣＡＧ
２０７６４／５８
第４外显子多态性检测
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｘｏｎ４ｂｙＳＳ
ＣＰ，ＲＦＬＰ
将扩增效果良好的ＰＣＲ产物原液送于北京百泰克生物技术有限公司进行测序，测序结果用Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ７ １软件包进行序列核对。
１ ４ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ反应条件
规划功能分区ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的反应体系为２０μＬ，其中ＰＣＲ产物７μＬ，１０×ＭＢｕｆｆｅｒ２μＬ，限制性内切酶ＨａｅⅢ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１０μＬ，置３７℃恒温反应１０ｈ后于２％琼脂糖凝胶电泳检测。
ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的反应体系为１０μＬ，取５μＬＰＣＲ扩增产物，加５μＬ变性剂，混合后９８℃变性１０ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ后上样于１２％聚丙烯酰凝胶，５Ｖ／ｃｍ电压室温电泳１８ｈ后，银染显，数码相机照相并记录聚丙烯酰胺凝胶上ＤＮＡ单链带，根据条带位置进行基因分型。
６
３云南农业大学学报 第２６卷
１ ５ 水牛β－ＬＧ基因的序列分析
将研究所用序列经ＣｌｕｓｔａｌＸ１ ８３比对，在ＭＥＧＡ４ ０中寻并输出突变位点。依照普通牛β－ＬＧ基因全序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＤＱ４８９３１９）的序列说明，将所测个体序列的３、４外显子片段剪切出来并拼接在一起组装成外显子拼接序列，用ＭＥＧＡ４ ０将其翻译成相应的蛋白质序列。２ 结果与分析
２ １ 水牛β－ＬＧ基因第３，４外显子ＰＣＲ扩增对水牛的β－ＬＧ基因第３、４外显子分别进行ＰＣＲ扩增，结果得到了特异性带，可用于测序，扩增片段中包含完整的外显子序列及其部分旁侧序列，分别为７３６ｂｐ和７３９ｂｐ（图１）
三维牵引床。
２ ２ 水牛β－ＬＧ基因第３，４外显子多态性
对属于１０个体的２２４头水牛的β－ＬＧ基
因第４外显子进行了多态性检测，所用检测方法
为ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法，检测区域包括
整个外显子及其前第３内含子４４ｂｐ和其后第４
内含子５２ｂｐ，共２０７ｂｐ的序列。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法
使用的检测酶为ＨａｅⅢ，该酶的酶切识别位点为
ＧＧ／ＣＣ，若所检测个体中有此位点，则酶切片段
为１３９ｂｐ和６８ｂｐ。该酶主要用于识别β乳球蛋
白第１１８位氨基酸的密码子是ＧＣＣ（与普通牛中
Ｂ等位基因一致），还是ＧＴＣ（与普通牛中Ａ等
位基因一致）。检测结果显示，在我们所研究的
所有个体中，均存在此酶切位点，且均以纯合子
状态存在（见图２），即水牛β乳球蛋白第１１８位
氨基酸的密码子均为ＧＣＣ。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的检测结
果未发现多态现象（见图３），也揭示所有水牛在
内科学
该位点为纯合子。
在已检测过的２２４头水牛中随机抽取了６９个
个体，用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对这些个体的β－ＬＧ
基因第３外显子进行多态性检测，检测区域包括
整个外显子及其前第２内含子１６５ｂｐ和其后第３
内含子１１８ｂｐ，共３５７ｂｐ的序列。发现有多态现
象，存在６种带型（见图４）。选取每种变异类型
个体进行了测序，结果显示所有突变均分布在内
含子区，在第３外显子区不存在突变（见图５）。
测序分析结果还表明所有水牛β－ＬＧ第６４位氨
基酸密码子与普通牛Ｂ变异体一样，均为ＧＧＴ
。
２ ３ 水牛及其近缘物种β－ＬＧ基因第３，４外显
子序列比较
由测序结果剪接出的β－ＬＧ基因第３，４外
显子拼接序列的比对结果进一步证实，不仅河流
型水牛和沼泽型水牛内部之间无差异，而且这两
黄河三角洲高效生态经济区
类水牛间此区域序列也无差异。
７
３第１期 祁 宏，等：水牛β－ＬＧ基因３，４外显子遗传特征分析
为进一步揭示水牛β－ＬＧ基因第３，４外显子的遗传特征，选取ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的水牛及其近缘物种同源序列进行了比较。结果显示，水牛、普通牛、山羊和绵羊的β－ＬＧ基因第３，４外显子长度完全相同，第３外显子均为７４ｂｐ，第４外显子均为１１１ｂｐ。但这４个物种的序列相比共发现９个ＳＮＰ（见图６），除第１９１和３５３位点（以起始密码子的第１位为第１位点）外，其余７个位点均为同义替换；第１９１和３５３位点分别对应于β－ＬＧ第６４和１１８位氨基酸密码子的第２位，这两个位点正好反映了普通牛β－ＬＧＡ、Ｂ等位基因间的差异。按照普通牛中的基因分型标准，水牛、山羊和绵羊序列中这２个位点与普通
牛Ｂ
等位基因的序列相一致。
３ 讨论
本文测序结果揭示河流型水牛和沼泽型水牛β
－ＬＧ基因的第３外显子均为７４ｂｐ，序列完全相同；它们的第４外显子均为１１１ｂｐ，序列也完全相同。通过同源序列比较，水牛β－ＬＧ基因第３，
４外显子编码氨基酸与普通牛Ｂ等位基因相应区域编码的氨基酸完全相同，针对其编码氨基酸的第６４和１１８位而言，两类水牛分别为Ｇｌｙ和Ａｌａ，相应的密码子分别为ＧＧＴ和ＧＣＣ。两类水牛多个体检测分析结果也揭示水牛β－ＬＧ基因相应于
普通牛的Ｂ等位基因，且第６４和１１８氨基酸位点
８３云南农业大学学报 第２６卷
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议