19卷4期2003年7月
生 物 工 程 学 报
Chinese Journal o f Biotechnology V ol.19 N o.4
July 2003
收稿日期:2003201206，修回日期:2003203210。
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2001AA214011)，国家自然科学基金(30270053)和教育部重点项目资助。3通讯作者:T el :86227287283455;Fax :86227287280670;E 2mail :m98sun @mail.hzau.edu
带cry 3Aa 启动子的aiiA 基因在苏云金芽胞杆菌中的表达 朱晨光 孙 明3
喻子牛
(华中农业大学生命科学技术学院，教育部暨农业部农业微生物重点实验室，武汉 430070)
摘 要 N 2乙酰高丝氨酸内酯(N 2acyl 2hom oserine lactones ,AH Ls )，是一类数量感知(Quorum 2sensing )系统中的信号分子，它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌的AiiA 蛋白能降解这类AH Ls 分子，进而可减弱病原菌致病基因表达产生的病害。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry 3Aa 的启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子，它相对于其它cry 类基因的启动子有启动基因转录时间早，转录时间长的优点。通过重叠延伸PCR ，用杀虫晶体蛋白基因cry 3Aa 启动子替换编码AiiA 蛋白的基因aiiA 自身的启动子，构建了融合基因pro 3A 2aiiA 。将融合基因装入穿梭载体pHT 304的Bam HI ΠS ph I 位点，得到重组质粒pBM B686并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株 BM B171，重组菌株BM B686的AiiA 蛋白表达量在各个生长时期均高于对照菌株，对AH Ls 分子的降解活性和对胡萝 卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力也明显优于对照菌株。关键词 乙酰高丝氨酸内酯，苏云金芽胞杆菌，杀虫晶体蛋白
中图分类号 Q784 文献标识码 A 文章编号100023061(2003)0420397205
N 2乙酰高丝氨酸内酯(AH LS )是一类广泛存在于许多革兰氏阴性细菌数量感知系统中的信号分
子，又称作“自身诱导物”(Autoinducers ,AIs )[1,2]
。
AH Ls 分子参与了许多病原菌致病基因的表达调控,顾炎武全集
其调控机理是:AH Ls 分子浓度随着细菌细胞数量的增多而升高，当AH Ls 分子浓度高到一定的阈值时，就可启动病原菌致病基因的表达
[1,2]
。胡萝卜软腐
欧文氏菌(Er winia carotovora )的软腐病基因调控就属于AH Ls 信号分子诱导调控[3]
。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis ,B t )因在芽胞期产生对昆虫、螨类、动植物寄生线虫以及原生动物有毒性的杀虫晶体蛋白而被广泛应用于农林业的生物防治聚合mdi
[4]
。最近有文献报道在苏云金芽胞杆菌
的不同亚种中，广泛存在着对AH Ls 分子有降解作用的蛋白AiiA ，这类蛋白通过水解AH Ls 分子的内
酯键，降低了AH Ls 分子的浓度，可使胡萝卜软腐欧文氏菌的软腐病基因得不到表达，从而减弱了胡萝卜软腐欧文氏菌对植物的软腐病害
[5,6]
。目前许多
甘肃政法学院学报
编码AiiA 蛋白的基因aiiA 已被克隆并测序[5,6]
。苏
云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry 3Aa 启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子，它相对其它cry 基
因的启动子有启动基因转录时间早，持续时间长的优点
[7]
，在构建苏云金芽胞杆菌基因工程菌时常被
采用。本文用基因cry 3Aa 启动子替换基因aiiA 自身的启动子，构建了融合基因pro 3A 2aiiA ，并对融合基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BM B171的表达、重组菌株BM B686对AH Ls 分子的降解活性
及其对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力等方面进行了研究。本研究结果表明融合基因
pro 3A 2aiiA 可用于构建抗植物软腐病的苏云金芽胞
杆菌基因工程菌。
1 材料和方法
1.1 菌株与质粒
菌株E .coli DH5α、Bacillus thuringiensis BM B171[8]
、
Er winia carotovora SCG 1
[5]
、质粒pHT 304[9]
(B .t 复制子,
氨苄青霉素抗性、红霉素抗性)、pHT 305A [7]
(含cry 3Aa 基因，氨苄青霉素抗性、红霉素抗性)、p GE MT 2aii (含
aiiA 基因，氨苄青霉素抗性，本室张琼博士构建)均
由本实验室保存。根癌农杆菌Agrobacterium tumef a 2
ciens WCF47[10]
(pCF372ΠpCF218，含有PtraI 2lacZ 融合基因和traR 基因，卡那霉素抗性、壮观霉素抗性、四
环素抗性)、大肠杆菌E.coli DH5α(pJ Z365)(含traI 基因，庆大霉素抗性)由美国康奈尔大学Stephen C Winans教授惠赠。大肠杆菌在37℃培养，苏云金芽胞杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌和根癌土壤杆菌均在28℃培养。大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌和胡萝卜软腐欧文氏菌用LB培养基培养，根癌农杆菌用M M培养基[11]培养。抗生素使用浓度：氨苄青霉素为100μgΠm L，红霉素为25μgΠm L，四环素为20μgΠm L，庆大霉素为30μgΠm L，壮观霉素为100μgΠm L，卡那霉素为50μgΠm L。
1.2 DNA操作及蛋白电泳
质粒的提取、酶切、连接、转化、PCR和蛋白S DS2PAGE均参照文献[12]的方法。蛋白定量采用上海四星生物技术公司生产的凝胶成像系统软件进行光密度测定后定量。
1.3 质粒电脉冲转化苏云金芽胞杆菌
按照文献[13]所述方法进行。
1.4 细菌Aii活性的检测
Aii(autoinducer inactivity)活性是指使AH Ls分子失去活性的能力。根癌农杆菌WCF47中含有质粒pCF372和pCF218，其中质粒pCF372含有PtraI2lacZ 融合基因，但自身缺失traI基因；质粒pCF218含有traR基因，其编码蛋白T raR受AI分子诱导后可激活PtraI2lacZ融合基因的表达[10]。大肠杆菌E.coli DH5α(pJ Z365)的质粒pJ Z365含有traI基因，其编码蛋白T raI可以大量合成AH Ls分子[10]。将加有X2gal的平板培养基切成细条，在细条的上端加入待测的样品，在样品的下面点接指示菌WCF47，当样品中存在AH Ls分子时，随着分子在培养基内不断向下扩散，激活WCF47中lac Z基因的表达，可使WCF47菌落呈现蓝；而样品中没有AH Ls分子或在AH Ls分子扩散不到的地方,WCF47菌落呈现白。
Aii活性检测参考了文献[14]的方法略有改进，以加有X2gal的M M琼脂培养基为测试培养基，用无菌小
刀将培养基琼脂切成间隔3mm的1cm宽的细条状。取待测菌的16h培养物20μL，与等体积的AH Ls分子产生菌DH5α(pJ Z365)的16h培养物混合，以20μL无菌水和20μL DH5α(pJ Z365)培养物的混合物作为对照。28℃作用1h，紫外灯照射1h。离心取上清液10μL加至检测平板上。待上清液基本被培养基吸收后，在样品下端逐个点指示菌WCF47 (OD
600
≈014)，每一点018μL。28℃培养24h后观察并记录实验结果。与对照相比，待测样品的点样处与最远的蓝WCF47菌落之间的距离若小于对照，表明该样品具有Aii活性，且距离越短则Aii活性越高，若与对照无差别，则表明该样品无Aii活性。1.5 胡萝卜软腐欧文氏菌致病性实验
11511 供试植物：取大小适当的马铃薯若干，用水仔细清洗，再用70%(VΠV)乙醇反复进行表面消毒。在无菌操作台上，在平板中铺入无菌滤纸，加2m L 无菌水以保持平板湿润，用无菌刀片将马铃薯切成厚度约为015cm的片状，然后放入平板中备用。11512 感染样品：取胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1的16h培养物和其4倍稀释液各20μL，分别与20μL苏云金芽胞杆菌菌株BM B171、重组菌株BM B686的16h培养物混合。28℃作用4h后，各取5μL混合物接种马铃薯。同时以SCG1的培养物原液和稀释液与无菌水的混合物接种马铃薯作为负对照。以BM B171培养物和SCG1的培养物及其稀释液混合后接种马铃薯作为正对照。将平板放在28℃培养,24h后观察并记录马铃薯是否出现软腐病斑及感病的程度。
2 结 果
教育手拉手论坛2.1 融合基因pro3A2aiiA的构建及其表达
根据质粒pHT305A上基因cry3Aa启动子序列设计一对引物，引物1:5′2CGG G ATCCG AAACG T AA2 G ATG AAACCTT AG23′；引物2:5′2T AAAG CTTCTTT ACT G TC ATTTTTCTTCCTCCCTT23′。根据质粒p GE MT2aii 上基因aiiA序列，设计另一对引物，引物3:5′2AAGG2 G AGG AAG AAAAA TG AC AG T AAAG AAG CTT T A23′；引物4: 5′2AG CTG C A TG CCT A TG T A T ACT CCGGG AAC A23′。用引物1和2扩增出基因cry3Aa的启动子片段，该片段3′端带有基因aiiA编码区的第1～20个碱基；用引物3和4扩增出基因aiiA的编码区片段，该片段5′端带有基因cry3Aa启动子末端的20个碱基。纯化两个扩增产物后，将两个DNA片段混在一起用引物1和4做PCR扩增，扩增产物为融合基因pro3A2aiiA(图1)，大约为1400bps左右，测序证明启动子pro3A与基因aiiA连接正确(结果未显示)。融合基因片段经Bam HI和Sph I酶切后，插入穿梭载体pHT304，构建成质粒pBM B686，经酶切验证与预计片段大小相符(图2)。
融合基因pro3A2aiiA在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BM B171中的表达见图3A。结合蛋白定量分析(图3B)可以看出在培养24h(营养期末期)时，重组菌株BM B686表达量略高于对照菌株，对照菌株BM B171本身也表达AiiA蛋白；培养至60h(芽胞
893生 物 工 程 学 报19卷
图1 融合基因pro3A2aiiA的构建示意图
Fig.1 The construction of fusion gene pro3A2aiiA pro3A,the prom oter of cry3Aa gene;primer2contains the first
20bps of 5′sequence of aiiA gene;primer3contains the last20bps of3′sequence of pro3A gene.
图2 质粒pBM B686及其酶切电泳图谱
Fig.2 Plasmid pBM B686and its agarose electrophoresis map Left:Plasmid pBM B686:3A2aii:aiiA gene with prom oter of cry3Aa; oriBt:origin of replication in B.thuringiensis;erm:Erm R2encoding gene;am p:Am p R2encoding gene;ori.Ec:origin of
replication
in
Right:Agarose electrophoresis map of pBM B686:11λDNAΠHin dⅢ
M arker;21pBM B686ΠBam HI2Sph I;31pHT304ΠBam HI2Sph I;41pro3A2
aii PCR fragment
图3 融合基因pro3A2aiiA在苏云金芽胞杆菌BM B686中的表达
Fig.3 The expression of the fusion gene pro3A2aiiA in B.thuringiensis BM B686
禁欲主义(A)1.B.thuringiensis BM B686,24h culture;2.B.thuringiensis BM B171,24h culture;3.B.thuringiensis BM B686,60h culture;4.B.thuringiensis BM B171,60h culture;5.B.thuringiensis BM B686,72h culture;6.B.thuringiensis BM B171,72h culture;M,protein m olecular weight marker.From12 6,each sam ples were made from5m L bacteria cultures respectively and loaded by using the same v olume.
(B)Densitometry of the28kD protein in panel A.The values on the ordinate are relative concentrations.The abscissa1,2,3indicate the24h cultures,60h cultures and72h cultures of strains BM B686and BM B171,respectively.
期中期)时，菌株BM B686的AiiA表达量已远高于对
照，表达量达到自身生长周期的最大值，此时对照菌
已几乎不表达AiiA蛋白；培养72h(芽胞期后期)后,
菌株BM B686的AiiA蛋白表达量较低，对照的表达量
也很低。以上结果说明融合基因pro3A2aiiA可以在
苏云金芽胞杆菌菌株BM B171的芽胞中期较好的表
达，其表达时间可从营养期末期开始一直至芽胞期。
2.2 细菌Aii活性的检测
Aii活性检测结果如图4。可以看出阴性对照
(DH5α(pJ Z365)+H2O)中含有使指示菌WCF47变蓝
的AH Ls分子的量最多，蓝扩散的最远；菌株
BM B171和DH5α(pJ Z365)的混合物也含有使指示菌
WCF47变蓝的AH Ls分子，但其样品到指示菌
WCF47蓝最远端的距离小于阴性对照，说明菌株
BM B171表现出了Aii活性，而菌株BM B686与DH5α
(pJ Z365)的混合物则几乎不使指示菌WCF47变蓝,
说明菌株BM B686的Aii活性要高于菌株BM B171。
菌株BM B171与无菌水的混合物也不使指示菌
WCF47变蓝，这说明苏云金芽胞杆菌BM B171不会
产生AH Ls分子，从而排除苏云金芽胞杆菌自身产
生AH Ls分子造成对结果干扰的可能。
2.3 胡萝卜软腐欧文氏菌致病性实验
从图5的结果可以看出：当菌株SCG1浓度较高
时，接种BM B171的马铃薯上出现较明显的软腐病
斑(图5左)；当菌株SCG1浓度较低时，接种BM B171
的马铃薯软腐病斑较小(图5右)。这说明菌株
萧然在线
BM B171的抑制软腐病的能力较弱，只有当环境中
菌株SCG1的浓度较低时才表现出对其致病性的抑
993
4期朱晨光等：带cry3Aa启动子的aiiA基因在苏云金芽胞杆菌中的表达
图4 苏云金芽胞杆菌BM B171和BM B686的Aii 活性检测
Fig.4 Detection of Aii activity in B .thuringiensis strains BM B171and BM B686
A.E .coli DH5
α(pJZ 365)+sterile ddH 2O ;B.E .coli DH5α(pJZ 365)+B .thuringiensis BM B686;C.E .coli DH5
α(pJZ 365)+B .thuring 2iensis BM B171;D.B .thuringiensis BM B171+sterile ddH 2O
制。但接种重组菌株BM B686的马铃薯在两种
SCG 1浓度下均完全不腐烂，说明重组菌株BM B686抑制软腐病的能力比对照菌株BM B171要强得多。
3 讨 论
许多植物病源细菌中存在着数量感知(Quorum 2sensing )系统，又称为细胞体浓度依赖(Cell 2densi 2ty 2dependent )系统，该系统调控病原菌致病基因的表达[1,2]。自身诱导物AH Ls 分子是病源菌数量感知系统中必不可少的成分,AH Ls 分子浓度降低后就不
能激活病源菌致病基因的表达[1,2,3]
。2002年Dong 等和Lee 等相继报道了在苏云金芽胞杆菌中广泛存在着aiiA 基因，其表达蛋白可使AH Ls 分子失活，从而使胡萝卜软腐欧文氏菌对植物产生的软腐病害得
以减弱[5,6]
。苏云金芽胞杆菌在上个世纪已被广泛应用于微生物杀虫剂的研究，但由于通常不能产生细菌和真菌敏感的抗生素而没有被应用于疾病防治，如能把苏云金芽胞杆菌开发成能够防治细菌或真菌病害的工程菌制剂，将使苏云金芽胞杆菌的应用领域得到大大的拓宽。
本研究目的是要构建抗植物软腐病的苏云金芽胞杆菌基因工程菌。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry 3A 启动子是一类不依赖芽胞形成的启动子，它启动的基因转录开始于苏云金芽胞杆菌营养生长期的末期，经过稳定生长期，一直持续到芽胞期
后期，在芽胞期中期时达到转录的高峰[7]
；而苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry 1、cry 2、cry 4类的启动子转录则起始于芽胞形成期，所以cry 3A 基因启动子相对于其它cry
基因的启动子有启动转录时间
图5 苏云金芽胞杆菌BM B686对胡萝卜软腐欧文氏菌
SCG 1软腐病的抑制检测
Fig.5 Detection of suppression of B .thuringiensis BM B686to the s oft rot disease caused by E .corotovora SCG 1
Both left and right plates :top is potato inoculated with B .thuringiensis BM B686and E .corotovora SCG 1,bottom left is potato inoculated with
B .thuringiensis BM B171and E .corotovora SCG 1,bottom right is po 2
tato inoculated with E .corotovora SCG 1and sterile ddH 2O.
Left plate :Before inoculation ,the E .corotovora SCG 1culture were not diluted by sterilized ddH 2O ;Right plate :Before inoculation ,the
E .
corotovora SCG 1culture were four 2times diluted by sterilized
ddH 2O.
长的优点，适合于在构建工程菌时发挥好的作用。本实验所用的苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BM B171自身也含有aiiA 基因，但从实验结果上看，该菌株Aii 活性不高，对胡萝卜软腐欧文氏菌产生软腐病害的抑制能力不强。其它一些苏云金芽胞杆菌天然菌株也是类似的情况。仅凭天然菌株自身的AiiA 蛋白表达量和蛋白活性还达不到工程菌的要求，因此我们设想通过体外遗传改良的手段，将高效表达的aiiA 基因如带cry 3Aa 启动子的基因pro 3A 2aiiA 转入天然菌株，来增强工程菌对软腐病害的抑制活性。本研究结果表明：带有cry 3Aa 基因启动子的aiiA 基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BM B171后,AiiA 蛋白可以得到比较高的表达，重组菌株BM B686对AH Ls 分子的降解活性和对马铃薯感
染软腐病的抑制能力也均远高于对照菌株BM B171。有关将融合基因pro 3A 2aiiA 导入高毒力天然苏云金芽胞杆菌菌株后对胡萝卜软腐欧文氏菌产生软腐病害的抑制活性方面，今后还将作进一步的实验研究。
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Expression of G ene aiiA C arrying the Promoter of G ene cry 3Aa in Bacillus thuringiensis
ZH U Chen 2G uang S UN M ing 3 Y U Z i 2Niu
(College o f Life Science and Technology ,K ey Laboratory o f Agricultural Microbiology o f Ministry o f
Education and Agriculture ,Huazhong Agricultural Univer sity ,Wuhan 430070,China )
Abstract N 2acyl 2hom oserine lactones (AH Ls ),are widely conserved signal m olecules present in quorum 2sensing systems of many G ram 2negative bacteria.AH Ls m olecules mediate the expression of virulence genes of a range of bacterial pathogens.Re 2cently ,it has been reported that AiiA protein ,which widely exists in Bacillus species ,can inactivate the AH Ls by hydrolyzing the lactone bond of AH Ls ,thus attenuate the diseases caused by the expression of virulence genes of bacterial pathogens.Bacil 2lus thuringiensis ,a type of G ram 2positive bacteria ,has been used extensively as a m icrobial insecticide in the last few decades.H owever ,m ost of im portant insecticidal B .thuringiensis strains have not been exploited for bacterial disease control because they usually do not produce antibiotics that are effective against bacteria and fungi.The discovery of AiiA protein in B .thuring 2iensis shows the application potential of B .thuringiensis on biocontrol against bacterial diseases.In this study ,in order to con 2struct the B .thuringiensis recombinant strain that has high expression of AiiA protein ,the prom oter of insecticidal crystal protein coding gene cry 3Aa of B .thuringiensis was selected.The prom oter of gene cry 3Aa is a non 2sporulation prom oter ,it prom otes the transcription earlier and longer than the prom oters of other cry genes.The prom oter of AiiA protein coding gene aiiA was re 2placed with the prom oter of gene cry
3Aa by overlapping PCR ,resulting fusion gene pro 3A 2aiiA .The gene pro 3A 2aiiA was in 2serted into shuttle vector pHT 304at site Bam H ⅠΠSph Ⅰ,resulting recombinant plasm id pBM B686.The plasm id pBM B686was introduced into B .thuringiensis acrystalliferous strain BM B171,the resulting strain BM B686had a higher and m ore stable expres 2sion level of protein AiiA com paring w ith the parental strain BM B171.Furtherm ore ,the strain BM B686exhibited stronger ability of AH Ls inactivation and much m ore effective restraint to the potato ’s s oft rot disease caused by Erwinia carotovora than th ose of the parental strain BM B171.From these results ,it was concluded that the B .thuringiensis strain harvesting the fusion gene pro 3A 2aiiA m ay be utilized in the future to control bacterial diseases which are m ediated by the AH L qu orum 2sensing signals.K ey w ords acyl 2hom oserine lactones ;Bacillus thuringiensis ;insecticidal crystal protein
Received :0120622003
This w ork was supported by G rants from the National H igh T echnology R&D Project of China (2001AA214011),National Natural Science F oundation (30270053)and K ey Project of M inistry of Education.
3
C orresponding author.T el :86227287283455;Fax :86227287280670;E 2mail :m98sun @mail.hzau.edu
1
044期朱晨光等：带cry 3Aa 启动子的aiiA 基因在苏云金芽胞杆菌中的表达
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