基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第11期，第513卜5137页
研究报告
Research Report
腾桥陈旗夏丽洁，
新疆大学生命科学与技术学院，生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐，830046
*通信作者，***********
摘要为揭示磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypiCan3,G P C3)在不同原核表达载体、菌株中的表达差异及重组蛋 白的最佳表达条件。本研究参照G e n B a n k中人G P C3基因序列(登录号：K R711270.1)设计引物，应用P C R技 术扩增基因全长，并将其构建至p E T30a-G P C3和p E T32a-G P C3两种不同的原核表达载体，而后分别转化于 3种不同的表达菌株(大肠杆菌B L21, Rossetta,Transetta)中，通过异丙基-p_D-硫代半乳糖苷(I P T G)诱导表 达磷酯酰肌醇蛋白聚糖重组融合蛋白，经S D S-P A G E电泳及Western B l o t鉴定比较蛋白表达量。为进一步提 高重组蛋白的表达量，通过设计不同的诱导剂I P T G浓度(0.3m m o l/L,0.5 m m o l/L,0.8 m m o l/L, 1.0m m o l/L)及 不同诱导时间(4 h,6h，8h，10 h)等优化诱导条件，经S D S-P A G E及Western B l o t鉴定比较蛋白表达量。实验 显示，C P C J去除信号肽后，基因全长1 749 b p，编码583个氨基酸。重组G P C3蛋白在不同表达载体和菌株 中表达情况及表达量均有差异。p E T32a-G P C3重组质粒在Transetta菌株中表达量最高。重组蛋白在诱导剂 I P T G浓度为0.5 m m o l/L，诱导时间为4 h情况下表达量较高。本研宄为进一步探究G P C3的生物学功能提 供了理论依据。
关键词磷酯酿肌醇蛋白聚糖3，融合蛋白，表达载体，表达菌株
The Expression Analysis o f Recombinant Glypican3 Protein in Different Prokaryotic Expression Vectors and Strains
T e n g Qia o C h e n Qi Xia Lijie*
Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046
*Correspondingauthor,***********
D O I: 10.13417/j.gab.039.005131
Abstract In order to reveal the expression difference of Glypican3 (G P C3) in different prokaryotic expression vectors and the optimal expression conditions of recombinant protein.In this study,according to the sequence of h u m a n GPC3gene in G e n B a n k(Accession n u m b e r:K R711270.1), primers w e r e designed a nd the full length of the gene w a s amplified b y P C R,and constructed into t w o different prokaryotic expression vectors p E T30a-G P C3 and p E T32a-G P C3.T h e recombinant fusion protein w a s induced b y isopropy卜p—D-thiogalactoside(I P T G)into three different expression strains of Escherichia coli B L21, Rossetta,Transetta.C omparative protein expression w a s i dentified by S D S-P A G E and Western Blot.In order to further improve the expression of recombinant protein,the induction conditions wer e optimized b y designing different I P T G concentration(0.3 m m o l/L,0.5 m m o l/L,0.8 m m o l/ L, 1.0 m m o l/L)and different induction time(4 h,6h,8h, 10 h).Protein expression w a s detected b y S D S-P A G E and Western Blot.T h e results s h o w e d that the total length of the GPC3gene w a s 1 749 b p,encoding 583 a m i n o acids.T h e expression and quantity of recombinant G P C3 protein w e r e different in different expression vectors a nd strains,while p E T32a-G P C3 recombinant plasmid w a s the m o s t expressed in Transetta strain.T h e expression of
基金项目：本研究由新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(N O.2016D01C078)资助
引用格式：T e n g Q.，C h e n Q.，a n d X i a L.J., 2020, T h e expression analysis o f r e c o m b i n a n t glypican3 protein in different prokaryotic ex- pression vectors a n d strains, Jiyinzuxue Y u Y i n g y o n g S h e n g w u x u e(G e n o m i c s a n d A p p l i e d Biology)，39(11): 5131-5137 (腾桥，陈旗，夏丽洁，2020，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在不同原核表达载体及菌株中的表达分析，基因组学与应用生物学，39(11): 5131-5137)
5132 基因组学与应用生物学
recombinant protein w a s higher w h e n the concentration of I P T G w a s0.5 m m o l/L,and the induction time w a s4 h. This study lays a foundation for further exploring the biological function of G P C3.
Keywords Glypican3,Fusion protein,Expression vectors,Expression strains
磷脂酰肌醇聚-3蛋白(glypican3,G P C3)是与过 度生长综合征（S i m p s o n-golabi-behmel s y n d r o m e)相 关的蛋白聚糖家族成员，C P C J基因位于人染体 X q26.1区，它的基因结构全长>900 k b，是人类基因 中最大的基因之一，它的启动子区包括6个S P I结 构、7个A P2结构和2个C A A T盒，产生2 130 b p的转录子，编码含580个氨基酸残基的G P C3蛋白 质前体。其相对分子质量约为66000，富含一段包括 14个半胱氨酸残基的独特序列，在其N末端具有分 泌型信号蛋白，C末端通过与糖基磷
脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上(S o n g and Filmus, 2002)。
G P C3与细胞的生长和分化密切相关，在原发性肝癌 的发生、发展过程中起重要作用(Capurro et al.，2005;
F i l m u s a n d C a p urro.，2008)。在肝癌早期，
G P C3 呈高表 达，对早期原发性肝细胞肝癌具有诊断价值(Ikeda et al.，2014: Vuillaume et al.，2018)。在转基因小鼠 中，G P C3的过度表达可抑制肝细胞增殖和肝再生(K i m e t a l.,2011)。同时在细胞水平上，G P C3与W n t s、
H e d g e h o g s、成纤维细胞生长因子密切相关，可调节 多种生长因子与其细胞表面受体的相互作用(H o a nd K i m,2011; G a o et al.,2015; H a r u y a m a and K a t a o-k a,2016; S u n et al.，2017)。慢病毒感染的肝癌细胞可 表达可溶型G P C3，其细胞增殖率较低，其通过分泌 可溶型的G P C3蛋白，从而与内源性细胞表面的G P C3竞争结合，达到抑制细胞增殖的目的以版卜 m a n n et a U2010)。研宄显示G P C3在原发性肝癌中 特异性高表达，而在卵巢癌细胞株、乳腺癌、肝细胞 癌旁组织、肝硬化、肝炎组织、成人正常肝组织低表 达或不表达(Lin et al.，1999; Peters et al.，2003; S u n g et al.，2003)。从而提示G P C3对肝癌诊断具有显著的 灵敏性和特异性，可作为识别H C C特异性肿瘤标志 物。早期诊断和是提高原发性肝细胞癌疗效的 关键因素之一。因此，无论是针对G P
C3的生物活性 研宄还是开发临床检测试剂盒，都需要制备大量 G P C3融合蛋白。目前，G P C3的制备受限于其表达量 较低。因此，本研究通过对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在 不同原核表达载体，及其在不同菌株中的表达进行 分析，进一步通过优化诱导条件，以期筛选获得可高 效表达的菌株，为后期深入研究G P C3的生物学功 能提供理论支撑。1结果与分析
1.1 GPC?原核表达载体构建成功
利用基因工程方法将连接产物p E T30a-G P C3和p E T32a-G P C3分别转化大肠杆菌克隆菌株D H5a 中。经L B抗性板筛选，随机挑取单克隆并培养阳性 D H5a重组菌株，提取质粒后，进行P C R和双酶切鉴 定，获得约1 749 b p片段(图1；图2)。测序结果显示与 预测基因大小和序列相同，证明重组质粒构建成功。
1.2 GPC3重组蛋白在不同的原核表达菌株中的表达情况
将己鉴定获得正确的重组质粒p E T30a-G P C3和 p E T32a-G P C3分别转化大肠杆菌B L21、Rossetta、Transetta三种不同的表达菌株，从而比较重组蛋白 的表达情况。在划线平1T T I上挑取单个菌落，过夜培 养，次日按2%接种于L B液体培养基，待检测O D值 达到0.6时，加入I P T G(0.5 m m o l/L)，诱导时间为6h，然后提取蛋白，进行S D S-P A G E分析。实验结果表 明：p E T30a-G P C3重组蛋白大小约为70k D，包含 G P C3目的蛋白65 k D和p E T30a载体标签蛋白5 k D (图3)，与预
期大小一致，经Western B l o t进行验证，其 融合蛋白大小与S D S-P A G E结果一致(图4);p E T32a-G P C3重组蛋白约为85k D，包含G P C3蛋白65k D 和p E T32a载体标签蛋白20k D，重组蛋白大小与预 期一致(图5)。经Western B l o t进行试验，并通过灰度 扫描软件im a g e J分析，结果表明p E T32a-G P C3在
M
5 000 bp 塌
3 000 bp -H
2 000 bp -S
1500 bp ,
1000 bp -M
750 bp -M
500 bp -m
莫里森公式250 bp -M
张宏涛 体操100 bp 邏
图丨重组质粒P C R鉴定
注：M: D L5000 D N A M a r k e r;1，2：分别为p E T30a-G P C3和 p E T32a-G P C3重组质粒
Figure 1Identification o f r e c o m b i n a n t plasmid b y P C R
Note: M: D L5000 D N A M a r k e r;1,2: T h e reco m b i n a n t plasmids
p E T30a-G P C3 a n d p E T32a-G P C3, respectively
749 bp
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在不同原核表达载体及菌株中的表达分析5133
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
sony cr33
500 bp
250 bp
100 bp M
1 2M l
2
3
4
5
6
7 8170 kD 130 kD 100 kD 70 kD 55 kD 40 kD 35 kD 25 kD 70 kD
图2重组质粒经E c o R I 与A 7^ I 双酶切鉴定
注：M : D L 5000 D N A M a r k e r ; 1，2：分别为 p E T 30a -G P C 3 和
p E T 32a -G P C 3重组质粒
Figure 2 R e c o m b i n a n t p lasmid identified b y double digestion o f EcoR I SLndXho I
Note: M : D L 5000 D N A M a r k e r ; 1,2: T h e r eco m b i n a n t plasmids
p E T 30a -G P C 3 a n d p E T 32a -G P C 3, respectively M l
2 3 4 5 6 7 870 kD 170 kD
130 kD
100 kD
70 kD
55 kD
40 kD
35 kD
25 kD
15 kD 图3重组质粒转化三种不同表达菌株S D S -P A G E 鉴定 注:M : Protein M a r k e r (10-170 kD); U : p E T 30a 空载体诱前，诱
后;3,4：分别为p E T 30a -G P C 3转
B L 21诱前，诱后；5,6：分别为 p E T 30a -G P
C 3 转 Rossetta 诱前，诱后;7,8：分别为 p E T 30a -G P C 3 转Transetta 诱前，诱后
Figure 3 Identification o f three different expression strains trans
f o r m e d b y r e c o m b i n a n t p l asmid S D S -P A G E
Note: M : Protein M a r k e r (10〜170 kD); 1，2: T r a n s f o r m e d bacterium
carrying p E T 30a e m p t y vector without induction a n d induced with
I P T G , respectively ; 3,4: p E T 30a -G P C 3 reco m b i n a n t p lasmid
without induction a n d i nduced with I P T G in B L 21, rspectively;
5,6: p E T 30a -G P C 3 r e c o m b i n a n t plasmid without induction a n d
induced with I P T G in Rossetta, rspectively; 7,8: p E T 30a -G P C 3
r e c ombinant pl a s m i d without induction a n d induced with I P T G in
Transetta, respectively Transetta 菌株中表达量较高(图6)。1.3 GPC 3重组蛋白的表达优化图4重组质粒转化三种不同表达菌株W e s t e r n B l o t 鉴定 注:M : Protein M a r k e r (10~170k D ); U ：分别为p E T 30a 空载体诱 前，诱后；3,4：分别为p E T 30a -G P C 3转B L 21诱前，诱后；5,6: 分别为p E T 30a -G P C 3转R o s s e t t a 诱前，诱后；7,8：分别为 p E T 30a -G P C 3转T r a n s e t t a 诱前，诱后；一抗为鼠源h i s 标签蛋 白，二抗为H R P 标记的山羊抗鼠Figure 4 Identification o f three different expression strains trans
f o r m e d b y r e c o m b i n a n t p l asmid W e s t e r n Blot
Note: M : Protein M a r k e r (10〜170 k D); 1，2: T r a n s f o r m e d bacteriu m carrying p E T 30a e m p t y vector without induction a n d in d u c e d with I P T G , respectively; 3,4: p E T 30a -G P C 3 r e c o m b i n a n t plasm i d without induction a n d in d u c e d with I P T G in B L 21, re
spectively; 5,6: p E T 30a -G P C 3 r e c o m b i n a n t pl a s m i d without induc- tion a n d induced with I P T G in Rossetta, respectively; 7,8: p E T 30a -G P C 3 r e c o m b i n a n t p lasmid without induction a n d in
d u c
e d with I P T G in Transetta, respectively; T h e first antibody is
m o u s e -d e r i v e d his labeled protein a n d the s e c o n d antibody is
H R P -l a b e l e d goat anti-mouse M l 2 3 4 5 6 7 8图5重组质粒转化三种不同表达菌株S D S -P A G E 鉴定 注：M : Protein M a r k e r (10~ 170 k D ); 1,2：分别为p E T -32a 空载 体诱前，诱后;3,4：分别为p E T 32a -G P C 3转B L 21诱前，诱后; 5,6：分别为p E T 32a -G P C 3转R o s s e t t a 诱前，诱后；7,8：分别为 p E T 32a -G P C 3 转 Transetta 诱前，诱后
Figure 5 Identification o f three different expression strains trans
f o r m e d b y r e c o m b i n a n t p l a s m i d S D S -P A G E
Note: M : Protein M a r k e r (10〜170 kD); 1,2: T r a n s f o r m e d bacteri
由于原核表达载体p E T 32a -G P C 3比p E T 30a - G P C 3在不同菌株中表达情况较好。因此，我们选择 p E T 32a -G P C 3做后续试验研究。由于p E T 32a -G P C 3 在Transetta 菌株中表达量较高，为了获取更好蛋 白表达量，通过设计不同的1P T G 浓度(0.3 m m o l /L , 0.5 m m o l /L ，0.8 m m o l /L ，1.0 m m o l /L )及不同诱导时
u m carrying p E T 32a e m p t y vector without induction a n d i n duced
with I P T G , respectively; 3,4: p E T 32a -G P C 3 r e c o m b i n a n t plas
m i d without induction a n d i nduced with I P T G in B L 21, rspec-
tively; 5,6: p E T 32a -G P C 3 r e c o m b i n a n t p l asmid without induc
tion a n d induced with I P T G in Rossetta, rspectively; 7,8:
p E T 32a -G P C 3 r e c o m b i n a n t p l asmid without induction a n d in
d u c
e d with I P T G
in Transetta, respectively
5134 基因组学与应用生物学
170 kD 130 kD 100 kD 70 kD 55 kD 40 kD 35 kD 25 kD M 1 2 3 4
85 kD
170 kD寒韩
130 kD
100 kD
70 kD
55 kD
40 kD
35 kD
25 kD
M 1 2 3 4 5
图6重组质粒转化三种不同表达菌株W e s t e r n B l o t鉴定
注：从卩1*(^比1^3呔61'(10〜17010));1，2：分别为口已丁323-0?匸3转 B L21诱前，诱后；3,4：分别为p E T32a-G P C3转R o s s e t t a诱前，诱后; 5,6：分别为p E T32a-G P C3转Transetta诱前，诱后；一抗为鼠源 h i s标签蛋白，二抗为H R P标记的山羊抗鼠
Figure 6 Identification o f three different expression strains transf o r m e d b y r e c o m b i n a n t p lasmid We s t e r n Blot
Note: M: Protein M a r k e r(10-170 kD); 1,2: T r a n s f o r m e d bacteriu m carrying p E T32a e m p t y vector without induction a n d induced with I P T G, respectively; 3,4: p E T32a-G P C3 r e c o m b i n a n t plasmid without induction a n d i n duced with I P T G in B L21,rspectively; respectively; 5,6: p E T32a-G P C3 r e c o m b i n a n t p lasmid without induction a n d i n d u c e d with I P T G in Rossetta, respectively; T h e first antibody is m o u s e-d e r i v e d his labeled protein a n d the s e c o n d antib o d y is H R P-l a b e l e d goat anti-mouse
间(4 h,6h,8h, 10 h)等优化诱导表达条件，并通过 S D S-P A G E电泳检测蛋白表达情况。实验结果表明 在诱导剂I P T G浓度为0.5 m m o l/L，诱导时间为4 h 情况下表达量较高(图7)。经Western B l o t及灰度扫 描软件i m a g e J分析，结果表明p E T32a-G P C3在诱 导剂丨P T G浓度为0.5 m m o l/L，诱导时间为4 h情况 下表达量较高(图8)，结果与S D S-P A G E结果一致。
2讨论
本研宄应用P C R技术扩增人C P C J基因全长 1749 b p，并将其构建至 p E T30a-G P C3 和 p E T32a-G P C3两种不同的原核表达载体，而后分别转化于大 肠杆菌B L21、Rossetta、Transetta三种不同的表达菌 株中，通过异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(1P T G)诱导 表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖重组融合蛋白，经S D S-P A G E电泳及W e s tern B l o t鉴定比较蛋白表达量，p E T32a-G P C3重组质粒在Transetta菌株中表达量最 高。重组蛋白在诱导剂I P T G浓度为0.5 m m o l/L，诱导 时间为4 h情况下表达量较高。
本实验选用的大肠杆菌表达系统，是目前最为 常用，且发展最早，也是最为成熟的表达体系之一。该系统是将外源基因通过原核乳糖操纵子结构原
A
170kD
130 kD
100 kD
70 kD
55 kD
40 kD
35 kD
25 kD
85 kD
图7重组质粒p E T32a-G P C3表达优化S D S-P A G E鉴定
注：M:Protein M a r k e r (10-170k D);A:1：为p E T32a-G P C3
转Transetta诱前，2~5：分别为不同浓度I P T G(0.3 m m o l/L, 0.5 m m o l/L，0.8 m m o l/L，1.0 m m o l/L)，B: 1：为 p E T32a-G P C3
转Transetta诱前，2~5：分别为不同诱导时间(4 h，6h，8 h, 10 h) Figure 7 Identification o f r e c o m b i n a n t plasmid p E T32a-G P C3 e xpression optimization b y S D S-P A G E
Note: M:Protein M a r k e r(10-170kD); A:1: p E T32a-G P C3 without induction in Transetta, 2~5: Induced with 0.3 m m o l/L,
0.5 m m o l/L, 0.8 m m o l/L, 1.0 m m o l/L,rspectively, B: 1:p E T32a-
G P C3 without induction in Transetta; 2~5: In d u c e d with 4h, 6h, 8 h, lOh, respectively
a b
M i 2""3~~4 \ 2 3 4
图8重组质粒p E T32a-G P C3表达优化W e s t e r n B l o t鉴定
注：M:Protein M a r k e r (10〜170 k D); a: p E T32a-G P C3转 Tran- setta 不同浓度 I P T G (1.0 m m o l/L,0.8 m m o l/L,0.5 m m o l/L，0.3 m m o l/L)，b: p E T32a-G P C3转 Transetta 泳道不同诱导时间 (4 h，6 h，8 h，10 h)
Figure 8 Identification o f r e c o m b i n a n t plasmid p E T32a-G P C3 e xpression optimization b y W e s t e r n Blot
Note: M:Protein M a r k e r(10-170 kD); a: p E T32a G P C3induction in Transetta with different concentrations o f I P T G (1.0 m m o l/L, 0.8 m m o l/L, 0.5 m m o l/L, 0.3 m m o l/L); b: 1:p E T32a G P C3 i nduction in Transetta with ditTerent time (4 h, 6 h, 8h, 10
汉之派
h)
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在不同原核表达载体及菌株中的表达分析5135
理，从而诱导重组蛋白表达的方法(夏丽洁等,2012：胡祥坤等，2018; Li et al.,2018)。该方法具有遗传背 景明晰，表达水平稳定，操作简便，具有较多菌株突 变体和含强启动子的载体等优势，同时，其成本低廉 且蛋白表达量高，且易于纯化等优点，目前己有多种 功能基因在原核系统中获得高效表
达（Ai etal., 2018; X u et al.，2018; Z h a n g et al.，2018)。本研究运用 大肠杆菌表达系统，获得较多的重组蛋白，与现有报 道结果一致。
本研究中所采用的B L21(D E3)菌株属蛋白酶缺 陷型菌株，该菌株内存在可表达T7溶酶菌的基因，可抑制目的基因的背景表达，同时不影响目的蛋白 的表达水平。来源于B L21系列宿主菌的Rossetta、Transetta菌株含有大肠杆菌稀少的真核细胞的密码 子，可增加真核细胞的蛋白表达水平，从而补充大肠 杆菌菌株所缺乏的6种稀有密码子，包括:A U A、A G G、A G A、C U A、C C C、G G A对应的 t R N A，从而提升 目的蛋白表达水平(K i m et al.,2017; H e et al.,2018)。因而，实验中选用含有大肠杆菌稀少的真核细胞的 密码子的菌株，尽可能提高蛋白表达水平。
本研究基于基因工程的手段和原核表达的方法 利用3种不同的大肠杆菌菌株B L21(D E3)、Rossetta 和Transetta成功表达重组G P C3蛋白，对表达结果 进行分析后发现，重组G P C3蛋白在不同表达载体 和菌株中表达情况及表达量均有差异。其中，以p E T30a作为表达载体在不同菌株中表达均有差异，且在Rossetta菌株中表达量较高，在B L21菌株中表 达较低，在Transetta菌株中不表达。而利用p E T32a 作为表达载体得到的重组G P C3蛋白的表达量要高 于以p E T30a作为表达载体的表达量。这可能由于两 种质粒的标签蛋白或结构的不同所造成的。因此，在 进行原核表达时表达菌株及质粒的选取也是需要考 虑的因素之一。本实验将G P C3构建于p E T系列两 种不同原核表达载体进行比较试验，选择合适的表 达载体及表达菌株，为进一步对重组G P C3蛋白的 生物学性质和功能研宂提供
了理论支撑。
3材料与方法
3.1试验材料
3.1.1实验菌株
大肠杆菌D H5a菌株、大肠杆菌B L21、Rossetta、Transetta三种不同的表达菌株、p E T30a和p E T32a 质粒，由生物资源与基因工程重点实验室保存。
3.1.2主要试剂
D N A限制性内切酶£c〇R I、狀〇I、
E X-7^酶、D L 5000 D N A M a r k e r、T4 D N A 连接酶、蛋白 M a r k e r 购自T a K a R a大连宝生物工程有限公司，S D S-P A G E 凝胶制备试剂盒、诱导剂I P T G购自北京索莱宝有限 公司，质粒提取试剂盒,P C R产物纯化回收试剂盒，凝胶回收试剂盒购自上海生工技术服务有限公司。P V D F膜购自M i n i p o r e公司。H i s标记的鼠源一抗，H R P标记的山羊抗鼠二抗I g G购自北京全式金生物 技术有限公司。
3.2试验方法
3.2.1G P C3原核表达载体的构建及鉴定
在N C B I中从G e n B a n k获取C P C?基因序列，设计扩增C P C J基因全长去信号肽的引物序列，引物 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。P C R 反应总体系为50 g L：缓冲液5 |jLL:d N T P2.5 i j l L；上下 游引物各 0.5 m_L:E x-7),，/ 酶 0.5 |jl L：模板 D N A 1
补灭菌水至50 |jl L。P C R反应条件：变性95°C3 m i n；变 性 95°C 20 s；退火 55°C 30 s；延伸 72°C 2 m i n；延伸 72°C 5 m i n；共30个循环(腾桥等，2017)。用1%琼脂 糖凝胶电泳检测P C R产物片段大小，将回收纯化的目 的片段、p E T30a和p E T32a质粒经£C0R I与A7jo 1 37°C恒温箱过夜酶切后，进行酶切产物回收，并通过 T4D N A连接酶16°C过夜连接，将连接产物转化大 肠杆菌D H5a感受态细胞过夜培养。随机挑取阳性克 隆进行培养，并提取质粒进行P C R和双酶切鉴定，将 鉴定正确的重组质粒进行测序分析，鉴定正确无突变 碱基后再分别转化入 £’.（•〇/;B L21、Rossetta、Transetta 三种不同表达菌株。
3.2.2 G P C3重组蛋白的表达检测
选取经鉴定正确的p E T30a-G P C3和p E T32a-G P C3重组菌株划线于L B固体培养基，挑取单克隆
37°C过夜培养，以1:50的接菌量移入L B培养基中，培养3 h后，当菌液值达到0.6时，向培养液中 添加 0.5 m m o l/L1P T G,37°C培养 4 h,12 000 r/min 离 心收集菌体，利用S D S-P A G E和Western B l o t检测 蛋白表达情况。
3.2.3 G P C3重组蛋白的表达优化
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选取表达量较高的原核表达载体，通过设计不 同的 1P T G浓度(0.3 m m o l/L,0.5 m m o l/L，0.8 m m o l/L，1.0 m m o l/L)及不同诱导时间(4 h,6h,8h，丨0h )等对
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