动物医学进展,021 ,42(3)=54-58
Progress in Veterinary Medicine
包佳鹭赵 伟2，路一璇s 何 欣1,，刘海隆八
（.河北农业大学动物医学院，河北保定071001 ； 2.涞水县农业农村局，河北涞水074 1 1 9；
3.河北省中兽药工程技术中心，河北清苑071100；
4.海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571 100）
摘 要：灌胃大黄建立小鼠腹泻模型，通过测定小鼠血清中和结肠组织中水通道蛋白3 （aquaporin 3 , AQP3）、水通道蛋白 4（aquaporin 4 , AQP4）及血管活性肠肽（vasoactive intestine polypeptide, VIP ）的含量
变化，探究大黄致泻下的作用机制。选取40只健康昆明种小鼠，随机分为4组，每组10只，B 、C 、D 组灌胃 不同浓度的大黄混悬液（B 组1 g/kg 、C 组2 g/kg 、D 组4 g/kg ） , A 组给予等体积的生理盐水，
连续灌胃5 d . 采用ELISA 、免疫组织化学法和荧光定量PCR 检测血清及结肠组织中AQP3、AQP4、VIP 的含量及表达情 况。结果显示，大黄组小鼠体重显著减轻，采食量减少，随给药剂量的增加，腹泻逐渐加剧,C 组、D 组小鼠血
清中AQP3、AQP4含量较A 组显著降低，结肠组织中AQP3、AQP4与VIP 表达量较A 组显著降低（P <
0.05），与B 组无明显差异。结果表明，大黄可通过降低AQP3、AQP4表达量来影响结肠对水的吸收，增加
肠道含水量，通过降低VIP 表达量使肠蠕动增加，从而使小鼠排便增加，引起腹泻。 关键词：大黄；水通道蛋白；血管活性肠肽；腹泻
中图分类号:S853.3
海峡两岸知识大赛
大黄｛Rheum palmatum L.）是蓼科植物掌叶大 黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎，性寒, 味苦，归大肠经，是我国传统四大中药之一，具有泻 下攻积、清热解毒、活血化淤的功效[1]，常用于 大便秘结、牙龈肿痛、口舌生疮等各种常见病。大黄
的主要作用部位在大肠，其重要活性成分结合蔥醌
在大肠内细菌酶的作用下还原为游离蔥醌苷，刺激 肠道导致腹泻2。现代药理学研究表明，大黄具有
泻下、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、利胆保肝、活血等 多种作用[3].大黄因其强大的泻下功能，不仅在便 秘上具有良好的疗效，同时也被广泛用于腹泻
模型建立中. 本试验通过检测血清及结肠组织中水 通道蛋白3、水通道蛋白4和血管活性肠肽的表达情
况，探究大黄致腹泻的主要机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验动物与药物昆明小鼠[SCXK （京）
2016-0002]40只，雌雄各半，购于斯贝福（北京）生
物技术有限公司；大黄，购自河北安国中药材市场。
1.1.2
试剂与仪器 AQP3抗体、AQP4抗体、VIP
抗体、多聚体抗兔/小鼠IgG-HRP.DAB 显试剂
文献标识码：A 文章编号:1007-5038（2021）03-0054-05
盒，武汉博士德生物有限公司产品；AQP3、AQP4
再生油ELISA 试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司产
品；Mark 酶标仪,Bio-Rad 公司产品;KD-BM 皿组
织包埋机,KEDEE 公司产品；KD-2508切片机，浙 江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；CK X41倒 置生物显微镜,Olympus 公司产品；SOP 分析天平,
赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品。
1.2
方法
1.2.1大黄混悬液的制备 将大黄粉碎，过200目
筛，临用前用60C 温水配制成所需浓度的混悬液。
1.2.2
给药方法 将小鼠随机分为4组，每组10
只。空白对照组（A 组）和大黄混悬液组（B 、C 、D
组），大黄组分别灌胃给予不同浓度的大黄混悬液（B
组1 g/kg 、C 组2 g/kg 、D 组4 g/kg ），空白对照组给
予等体积的生理盐水，连续灌胃5 d ，给药前和给药 后分别记录小鼠体重，每天记录采食量和腹泻情况。
给药结束后眼眶静脉采血，脱颈椎处死小鼠，摘取结
肠组织，一部分用40 mL/L 多聚甲醛固定，一部分 于一80C 保存备用。
可比价
1.2.3
结肠组织病理形态学观察取部分固定结肠
组织常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，常 规HE 染，再经乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶
收稿日期：2019-11-08
基金项目：十三五”国家重点研发计划项目（2017YFD0501500）；国家自然科学基金项目（31872508）
作者简介：包佳鹭（ 1994 — ），女，河北廊坊人，硕士研究生，主要从事中药药理与动物疾病的中兽医防治。*通讯作者
包佳鹭等：大黄对小鼠水通道蛋白3、及血管活性肠肽的影响55
封片，显微镜下观察并拍照.
1.2.4ELISA检测AQP3、AQP4含量小鼠眼眶
静脉采血，分离血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）
检测血清中AQP3、AQP4含量.
1.2.5免疫组化检测结肠中AQP3、AQP4、VIP表
达量取部分固定结肠组织常规石蜡切片，二甲苯
脱蜡，梯度酒精脱水,30mL/L过氧化氢孵育，山羊
血清封闭，滴加一抗,4C过夜，次日滴加二抗,DAB
显后滴加终止液，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中
表1
Table1Real-time PCR primer sequences
荧光定量PCR引物序列
基因Gene序列(3‘-5‘)Sequence GC/%Tm片段大小/bp Length
AQP3F TGACCTTCGCAATGTGCTTC5062.3
196 R GGATAGGTGGCAAAGATTCCAG5062
AQP4F AGCTGTGATTCCAAACGAACTG45.561.6
144 R CATGATAACTGCGGGTCCAA5061.8
VIP F GAGCAGGTGACCCTGACCAA6063.6
148 R AGAAGTCTGCTGTAATCGCTGGTG5064.1
p-actin F TCCTTCCTGGGCATGGAGT57.963
104 R AGCACTGTGTTGGCGTACAG5560
注：-actin为内参基因.
Note:p-actin is an internal reference gene.
花谢旧金山2结果
2.1大黄给药前后小鼠体重变化
给药前各组小鼠体重无明显差异，给药后C组和D组小鼠体重显著低于A组（P<0.05）.小鼠采食量随
给药剂量的增加而不断减少.给药2.5h 后小鼠开始陆续出现腹泻症状，随给药剂量的增加，腹泻程度逐渐加剧，腹泻率增加.其中B组腹泻率为90%,C组和D组腹泻率均为100%（图1）.性树胶圭寸片，显微镜下观察并拍照.用Image-Pro Plus软件对AQP3、AQP4、VIP的表达水平进行半定量分析.
1.2.6荧光定量PCR检测结肠中AQP3、AQP4和VIP表达量取一80C保存的结肠组织匀浆，进行总RNA提取和反转录，荧光定量PCR采用两步法，扩增程序为：95°C30s,95°C5s,60°C30s,40个循环。熔解曲线程序为：95°C10s,65°C60s，以0.1°C/s的速度升温至97°C，最后37°C30s冷却（表1）.
2.2ELISA检测大黄致泻小鼠血清中AQP3和AQP4变化
灌服不同剂量的大黄混悬液后，小鼠血清中AQP3和AQP4含量逐渐降低.C组和D组血清中AQP3和AQP4含量与A组相比显著降低（P< 0.05）,B组与A组、C组和D组无显著差异（P> 0.05）（表2）.
给药时间/d
Time
给药前给药后
Before After
administration administration
“o”代表与空白对照组差异显著(P<0.05)
o Represents significant difference from the blank control group(P<0.05)
图1大黄给药前后小鼠体重和采食量变化变化
Changes in body weight and feed intake of mice before and after Rheum palmatum L.administration Fig.1
2.3大黄致泻小鼠结肠组织病理形态学观察
各组结肠组织结构正常，黏膜完整，未见增生，萎缩，坏死等病理变化，杯状细胞，隐窝，腺体结构正常，排列整齐，均未见明显变化（图3）.2.4大黄腹泻模型小鼠结肠免疫组化结果
灌服不同剂量的大黄混悬液后，小鼠结肠中AQP3、AQP4和VIP的表达量均有所下降，且呈现剂量依赖趋势.C组和D组结肠中AQP3表达量显著低于A组，A、B组间无显著差异（P>0.05）
56动物医学进展2021年第42卷第3期（总第333期）
C组和D组结肠中AQP4表达量显著低于A组，且D组AQP4表达量与C组相比显著降低（P< 0.05）,A、B组间无显著差异（P〉0.05）。C、D组结肠中VIP表达量显著低于A、B组,A组和B组、C 组和D组间差异不显著（P〉0.05）。
2.5大黄腹泻模型小鼠结肠AQP3、AQP4和VIP 的RT-qPCR结果
小鼠灌服不同剂量的大黄混悬液后，AQP3、AQP4和VIP的mRNA表达量均有所减少。大黄组结肠AQP3mRNA与空白对照组相比表达量下表2大黄腹泻小鼠AQP3、AQP4变化结果Table2Changes of AQP3and AQP4in diarrheal mice induced
by Rheum palmatum L.
组别Groups AQP3AQP4
A140.00+4.78c121.47+5.31c
B137.21+4.33bc117.01+4.93bc
C134.10+4.69ab112.16+5.83"〉
D130.04+4.94a107.17+6.60a
注:A组为空白对照组,B组为1g/kg组，C组为2g/kg组，D组为4 g/kg组，每列不同小写字母之间差异显著（P<0.05）。
Note：Group A was control group,B,C,D were1g/kg,2g/kg and4 g/kg groups?different,lowercase letters in the same column mean significant.differences(P<0.05).
调，其中2g/kg组、4g/kg组AQP3mRNA显著低于空白对照组（P<0.05），且2个试验组之间无显著差异（P〉0.05）,1g/kg组与空白对照组无显著差异（P〉0.05）。各大黄组结肠AQP4mRNA与空白对照组相比均显著下调，且各组之间差异显著（P<0.05）。各大黄组结肠VIP mRNA与空白对照组相比均显著下调，其中2g/kg组、4g/kg组VIP mRNA显著低于1g/kg组（P<0.05）,4g/kg 组与2g/kg组无显著差异（P〉0.05）。
表3大黄致泻小鼠结肠AQP3、AQP4和VIP表达量
注:A组为空白对照组,B组为1g/kg组，C组为2g/kg组，D组为4 g/kg组，每列不同小写字母之间差异显著（P<0.05）。
Table3Expressions of AQP3,AQP4and VIP in colon of diarrhea mice induced by Rheum palmatum L.
组别Groups AQP3AQP4VIP A4076+224c5563+254c5062+267b
B3768+195bc51.20+3.83"4807+290b
C35.41+2.65"〉4710+136b42.83+2.35a
D32.33+3.18339.55+2.52a41.97+2.393
Note:Group A was control group,B,C,D were1g/kg,2g/kg and4 g/kg groups?different,lowercase letters in the same column mean significant.differences(P<0.05).
A.空白对照组；
B.1g/kg组；
C.2g/kg组；
D.4g/kg组(HEX400)
A.Blank control group；
B.1g/kg group；
C.2g/kg group；
D.4g/kg group(HEX400)
图2大黄腹泻小鼠结肠形态结构变化
Fig.2Morphological changes of colon in diarrhea mice induced by Rheum palmatum L.
A.空白对照组；
B.1g/kg组；
C.2g/kg组；
D.4g/kg组，箭头为AQP3阳性表达
A.Blank control group；
B.1g/kg group；
C.2g/kg group；
D.4g/kg group,arrow indicates AQP3positive expression
图3大黄腹泻小鼠结肠AQP3表达量
Expressions of AQP3in colon of diarrhea mice induced by Rheum palmatum L.
Fig.3
3讨论
大黄性味苦寒，归于大肠经，能够清热泻火，除烦止渴［］，主要用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽［］，大黄泻下的主要作用部位在结肠［］。结肠在维持机体体液和电解质平衡中起着重要的作用，正常情况下结肠上皮每天吸收1.5L〜2L水产生脱水粪便［7］，结肠上皮水运输是通过细胞旁路和跨细胞通路来完成的，跨细胞通路又包括自由扩散和协助扩散（即水通道扩散）两种方式［］
。
包佳鹭等：大黄对小鼠水通道蛋白3、4及血管活性肠肽的影响
57
A.空白对照组；
B.1 g/kg 组；
在显像管的电子中
C.2 g/kg 组；
D.4 g/kg 组，箭头为AQP4阳性表达
A. Blank control group ；
B.1 g/kg group ；
C.2 g/kg group ；
D.4 g/kg group, arrow indicates AQP4 positive expression
图4大黄腹泻小鼠结肠AQP4表达量
Fig.4 Expressions of AQP4 in colon of diarrhea mice by Rheum palmatum L.
A. Blank control group ；
B.1 g/kg group ；
C.2 g/kg group ；
D.4 g/kg group, arrow indicates VIP positive expression
图5大黄腹泻小鼠结肠VIP 表达量
Fig.5 Expression of VIP in colon of diarrhea mice induced by Rheum palmatum L.
5
5
1± 1± c u 上
d l -I n u !
U O I S S U J d x g
u u g o
-歸址坦浪週昭
* ”代表与空白对照组差异显著(P <0.05)
* Represents significant, difference from the blank control group (P <0.05)
图6 AQP3、AQP4和VIP 基因荧光定量PCR 结果
Fig.6 FluorescentquantitativePCRresultsofAQP3,
AQP4 and VIP
水通道蛋白(AQPs )是几乎所有物种(包括病
毒)中存在的跨膜蛋白家族，可选择性地将水或其他 小分子物质运输到生物膜上［］。研究证实AQPs 广 泛分布于肠道中：10：，在肠道通透性和液体的分泌与
吸收中发挥重要作用，在肠道水液代谢中有着重要 意义［1］。AQP3是结肠吸收水分的重要通道，有研 究表明AQP3在结肠黏膜上皮细胞质膜上高度表 达：12：，其表达量水平与结肠对水的吸收功能密
切相 关,AQP3可控制水从肠道向血液传送，以此来调节
粪便的含水量［3］。AQP3的低表达会影响水分从
肠腔到肠壁的转运，使结肠对水的重吸收障碍，因此 导致腹泻皿。除AQP3外，AQP4是在结肠黏膜表
达较高的水通道蛋白，可促进结肠上皮细胞对水的 重吸收：15：.研究显示，5-氟尿嘧啶诱导的腹泻小鼠
结肠中AQP4的基因表达水平显着下降，从而导致
小鼠体重减轻和腹泻［6］。研究表明，轮状病毒腹泻 小鼠结肠AQP4表达量显著降低，证实AQP4在腹 泻中起重要作用：17：.本试验研究显示，大黄会导致
结肠中AQP3和AQP4表达量下调，从而使结肠对
水的吸收减少，使粪便含水量增加，进而导致腹泻。
VIP 是肠道肌间神经从中的抑制性神经元递
质，主要集中在结肠壁的平滑肌层：18：，在肠道蠕动
时参与下行性松弛，主要起调节肠道运动的作用。
研究表明，VIP 与受体结合后可活化蛋白激酶A，引 起平滑肌超极化，使结肠运动减慢［9］。VIP 表达量 的降低可使肠道动力和分泌功能紊乱，导致机体产 生腹泻。研究发现脾虚大鼠结肠VIP 含量显著下
降，与本试验研究结果一致⑵］。本试验研究发现, 大黄可降低结肠组织中VIP 的含量，通过降低VIP
的含量对结肠平滑肌的蠕动产生影响，增强肠蠕动 力，促进肠道运动。
本试验结果表明，大黄可导致血清和结肠中
AQP3和AQP4表达量下降，使肠道内水分增多，同
时结肠中VIP 表达量下降，肠蠕动加快，从而导致
排便增加，引起腹泻。参考文献：
口］梁淋渊，甘麦邻，罗燕.大黄在兽医临床上的应用［J ］.中兽医
学杂志,016(4):22-22.
［2］ 李 锋，王胜春，王 新，等.大黄泻下效应的药理学新解释
［J ］.中国中药杂志,008,33(4):481-484.
［3］ 于建玉，廖 欣，丁厚伟，等.中药大黄药理作用研究进展及其
临床应用［J ］.中国现代药物应用，2016,10(11):286287.
［4］ 赵进喜，张立山，马淑然，等.大黄芒硝，推陈出新；大戟甘遂，峻 下逐水［J ］.环球中医药,
019(4):564-567.
58动物医学进展2021年第42卷第3期（总第333期）
[]贺沙沙，程芳，窦霞，等.大黄水根与大黄抗菌成分含量的比较研究[].中华中医药杂志,019(6):2664-2668.
[]李锋，王胜春，王新，等.大黄泻下效应的药理学新解释[].中国中药杂志,008(4):481-484.
[7]JONATHAN Y,STEPHEN K,QI W,t al.Characterization of
AQPs in mouse,rat,and human colon and their selective regulation by bile acids[J].Front Nutri,2016,3：1-20.
[]刘二俊.“物质跨膜运输的方式”细节内容补充[J].中学生物教学,019(9)44-45.
[]张凯琦，张迪，刘树明，等.肠道中水通道蛋白的表达和功能研究进展[]•黑龙江畜牧兽医,017(9):8284.
[0]NOBUTOMO LRISAKO K,KIYOSHI S.Aquaporins in the
colon as a new therapeutic target in diarrhea and constipation
[J].IntJMolSci,201617(7)：1172-1182.
[1]RICANEK P,LUNDE L,FRYE S,et al.Reduced expression
ofaquaporinsin humanintestinal mucosainearlystagein-
flammatoryboweldisease[J].Clin Exp Gastroenterol，2015，
8：49-57.
[12]CHAO G Q,ZHANG S.Aquaporins1,3and8expression and
cytokines in irritable bowel syndrome rats'colon via cAMP-
PKA path way[J].IntJClin ExpPathol，2018，11(8)：4117-
4123.
[3]IKARASHI N N,KON R R JIZASA T T,t al.Inhibition of
aquaporin-3waterchannelinthecoloninducesdiarrhea[J].
BiolPharmacBu l，2012，35(6)：957-962.
[4]WEI Z,LONG X,PEDIATRICS D O.Change of AQP3ex-
陆航飞行员开箱国产最先进武装直升机pressionincolonofratsofdi f erentdegreesofdiarrhea[J].
Syst Med，2017，2(7)：14-19.
[5]赵琼，黄勤挽，代渊，等.加味人参乌梅汤对腹泻大鼠
AQP4及其相关调控因子的影响[].中国实验方剂学杂志,
2015，21(7)：99-102.
[6]SAKAI H,SAGARA A^MASTUMOTO K,t al.Neutrophil
recruitmentiscriticalfor5-fluorouracil-induceddiarrheaand
thedecreaseinaquaporinsinthecolon[J].PharmacolRes，
2014，87(9)：71-79.
[7]CAO M t YANG M,OU Z,et al.Involvement of aquaporins in
a mouse modelofrotavirusdiarrhea[J].Virologica Sinica，
2014，29(4)：211-217.
[8]陈晓敏，张燕华，毛峻岭，等.肠易激综合征患者结肠黏膜P物
质、血管活性肠肽和肥大细胞的变化[].胃肠病学,008,3
(4)：228-230.
[9]贾蕊，邢海娇，张选平，等.不同刺灸法对功能性便秘大鼠血
浆一氧化氮、一氧化氮合酶及结肠血管活性肠肽的影响[].
针刺研究,017,(1):5055.
[0]李宝红，贺旭，马惠苹，等.脾虚证大鼠胃肠道VipYNnNos
神经元共存[].继续医学教育,011,5(5)6-62.
Effects of Rheum Aquaporin3/4and Vasoactive
Intestinal Peptide on Mice
BAO Jia-lu1,ZHAO Wei2,LU Y-xuan1,HE Xin1'3,LIU Hai-ong4
(1.College of Veterinary Medicine,Hebei Agricultural University,Baoding,Hebei,071000»China；2Bureau of Agriculture and Rural Affairs,Ldlzid,Hebei, 074100»China；3Engineering Technology Center of Traditional Chinese Medicine of Hebei,Qingyuan, Hebei, 071100»China；4Hainan Acade
my of Agriculture Sciences<,Animal Husbandry and Veterinary Institute,Haikou,Hainan.,571100»China) Abstract:In order to investigate the mechanism of Rheum palmatum L.induced diarrhea,a model of diarrhea in mice was established by gavage of Rheum palmatum L.,and the contents of aquaporin3(AQP3), aquaporin4(AQP4)and vasoactive intestine polypeptide(VIP)in the serum and colon tissue of mice were determined.Forty healthy Kunming mice were selected and randomly divided into4groups of10mice each. GroupsB，C，andD wereadministered with Rheumpalmatum L.suspensionsofdi f erentconcentrations (group1g/kg,group C2g/kg,Group D(4g/kg))intragastrically for5days,group A was given an equal volumeofnormalsaline.ThecontentsandexpressionsofAQP3，AQP4，VIPinserumandcolontissuewere detectedbyELISA，immunohistochemistryandfluorescentquantitativePCR.Theresultsshowedthatthe miceinthe upssignificantlyreducedbody weightandfeedintake.Withthein-crease of the dose，diarrhea gradua l y intensified.The levels of AQP3and AQP4in the serum of the mice in heCandDgroupsweresignificantlylowerthanthoseintheAgroup，andtheexpressionlevelsofAQP3，AQP4andVIPinthecolontissueweresignificantlylowerthanthoseingroupA(P<0.05)，andtherewas no significant,difference from group B.The results showed that.Rheum palmatum L.can affect,the colon's absorptionofwaterbyreducingtheexpressionsofAQP3andAQP4，increasingtheintestinalwater
content andthebowelmotilitybyreducingtheexpressionofVIP，therebyincreasingbowelmovementsinmiceand causingdiarrhea.
Key words：Rheumpalmatum L.；aquaporin；vasoactiveintestinepolypeptide；diarrhea
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议