现物医学biomedjoumals Progress in Modern Biomedicine V〇L20 NO^l NOV*2020• 4007 •doi: 10.13241/jki.pmb.2020.21.002
CX3CL1 RN A干扰慢病毒载体的构建包装与鉴定* 柏秀娟郭艳蛾时霄冰孙博吴卫平A
天空游戏宝典(中国人民解放军总医院第二医学中心神经内科北京100853)
摘要目的：构建包装趋化因子C X3C的配体1(CX3CL1)RNA干扰慢病毒栽体。方法：参考目的基因CX3CL1序列，设计P C R引物扩增相应的干扰序列，然后将干扰序列连接至pLVX-shRNA2酶切后的线性化栽体上，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，即为构建成功的pLVX-shRNA2-CX3CLl慢病毒干扰栽体。将构建好的慢病毒干扰载体同慢病毒包装栽体共同转染293T细胞，收 集上清，纯化浓缩后即为pLVX-shRNA2-CX3CLl慢病毒。最后将慢病毒感染B M SC s细胞,QPCR检测慢病毒的干扰效率结果：经过酶切能切出大小约为6500bp和1350bp的两条带，获得与预期结果相一致的D N A片段，并通过测序验证了序列的准确性，成功构建CX3CL1 R N A慢病毒干扰栽体。然后经过包装、纯化浓缩后得到pLVX-shRNA2-CX3CLl慢病毒UQPCR结果表明干扰 组明显抑制了C X3C Llm R N A的表达，干扰效率在70%以上。结论：成功构建包装CX3CL1干扰慢病毒栽体，并证实其显著沉默 了BM SCs细胞C X3C L1的表达，为CX3CL1在BM SCs移植的大鼠缺血性脑卒中炎症反应的机制研究奠定基础。 关键词:C X3C L1;R N A干扰；骨髄间充质干细胞；缺血性脑卒中；慢病毒
中图分类号:R-33;Q78;R743文献标识码:A文章编号：1673-6273(2020 )214007-06
Construction, Packaging and Identification of CX3CL1 RNAi
Lentiviral Vector*
BAIXiu-juan, GUO Yan-e, SHI Xiao-bing, SUN Bo, WU Wei-pin^
(Neurological Department o f t he Second Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing, 100853, China) ABSTRACT Objective: To construct and pack CX3CL1 RNAi lentiviral vector. Methods: With reference to the target gene CX3CL1 sequence, PCR primers were designed to amplify the corresponding interference sequence. Then the interference sequence was connected to pLVX-shRNA2 linearized vector.Positive clones were obtained by identification o f PCR and digestion, which was a successful construction o f pLVX-shRNA2-CX3CLl Lentiviral interference vectors. The constructed RNAi lentiviral vector was transfected into 293T cells together with the packaging vectors. The supernatant was collected, purified and concentrated to pLVX-shRNA2-CX3CLl lentivirus. Finally, BMSCs were infected with lentivirus, and the interference efficiency was d
etected by QPCR. Results: After digestion, two bands with 6500bp and 1350bp were obtained consistent with the expected results, and the sequence accuracy was verified by sequencing. The CX3CL1 RNAi lentiviral vector was successfully constructed.After packaging, purification and concentration, the pLVX-shRNA2-CX3CLl lentivirus was obtained. QPCR results showed that the interference group significantly inhibited the expression o f CX3CLlmRNA, and the interference efficiency was above 70%. Conclusion: The CX3CL1 RNAi lentiviral vector was successfully constructed and packed and significantly silenced the expression o f CX3CL1 o f BMSCs, which laid the foundation for the study o f the mechanism o f CX3CL1 on inflammatory response of ischemic stroke in BMSCs transplanted rats.
Keywords: CX3CL1; RNA interference; BMSCs; Ischemic stroke; Lentivirus
Chinese Library Classification(CLC): R-33; Q78; R743 Document code: A
Article ID: 1673-6273(2020)21-4007-06
刖目
缺血性脑卒中是导致人类残疾、死亡的重要疾病之一
是由血栓或栓塞导致血管阻塞引起脑组织缺血、缺氧，进一步 可致脑组织神经元发生不可逆性死亡，同时启动了缺血局部组 织的非特异性炎症反应，过度的炎症反应可进一步加剧脑组织 的继发性损伤。近年来，已有研究证实间充质干细胞(M SC)可 以改善脑卒中动物缺损的神经功能，但主要集中在神经再生及修复方面[3'41，对M SC能否调控卒中后炎症反应鲜有报道。据知 小胶质细胞在脑缺血炎症反应中起着”双刃剑"的作用，促炎 型小胶质细胞发挥组织防御、吞噬坏死组织等功能；抗炎型小 胶质细胞起着脑保护和促进神经再生的作用M。因此，调控小 胶质细胞从促炎型向抗炎型转化，将成为降低缺血性脑卒中损 伤、促进神经修复潜在的靶点
近年很多研究结果表明M SC对小胶质细胞的激活、增殖 及功能均可产生一定的影响，但具体机制尚不十分清楚。据文
*基金项目：首都卫生发展专项科研合作项目（2016-1-1031)
作者简介：柏秀娟（丨975- >，女，硕士，主治医师，主要研究方向：脑血管病，电话：丨3269330993, E-mail: baixiujuan 1225@丨26 △通讯作者：吴卫平，男，博士生导师，教授，主要研究方向：脱髓鞘疾病及脑血管病.E-mail:*************
(收稿日期:2020-05-18接受日期:2020-06-15 >
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献报道,CX3CL1可能参与了 MSC对小胶质细胞的调控。在中 枢神经系统,CX3CL1-CX3CRI信号途径在维持小胶质细胞的 功能发挥重要作用，此信号途径激活后小胶质细胞主要表现为 神经保护型，而破坏此途径后小胶质细胞表现为神经毒型|I U21。我们推测.MSC能逆转缺血性脑卒中小胶质细胞表型、功能的 转化，从而调控炎症反应。因此，我们拟在构建大鼠MCAO模 型的基础上移植BMSCs，以期阐明BMSCs能否通过分泌CX3CL1逆转抗炎型、促炎型小胶质细胞在脑组织的分布，抑 制脑卒中缺血区炎症反应。本实验成功构建包装CX3CL1干扰 慢病毒载体，为进一步研究CX3CL1在BMSCs移植的大鼠缺 血性卒中炎症反应的机制方面奠定基础。
1材料与方法
1.1实验动物与试剂
S D大鼠,3周龄，购于重庆医科大学实验动物中心。质粒 pLVX-shRNA2、质粒psPAX2、质粒pMD2.G购自淼灵生物。293T细胞购自上海中科院细胞库。DMEM培养基、DMEM-F12培养基购自美国的GffiCO公司。PrimeSTARTM HS DNA聚合酶购自日本的TaKaRa公司。质粒小量抽提试剂 盒购自美国的 Promega公司。DNaseI(RNase-free)、ExTaqTM
R-PCR ver.2.1、RNase抑制剂购自曰本的TaKaRa公司。AMV Reverase Transcriptase 购自美国的Promega 公司。DL2000 DNA ladder、tf〇m«IJVodjco/fl 购自日本的 TaKaRa公司。T4 DNA ligase buffer购于美国的NEB公司。Primer购于上海 生工。NucleoBond Xtra Midi Plus 购于德国的 MACHEREY-NAGEL公司。制备感受态试剂盒购于美国的BIOSCIENCES 公司。NED3000购于重庆市威斯腾生物科技有限责任公司。R-CD29 PE 流式抗体、R-CD44 PE 流式抗体、R-CD31 eFlu-〇r660式抗体、R-CD45 eFluor660流式抗体购于美国的ebio-science公司。
1.2pLVX-shRNA2-CX3CLl 质粒构建
1.2.1pLVX-shRNA2载体的线性化 pLVX-shRNA2载体上 2439位点和2456位点分别为SomHI和的酶切位点，用 限制性的内切酶jSomHI、&»/?I酶切载体pLVX-shRNA2。酶切 反应条件:37°C酶切4h小时，然后琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0 进行纯化;，
1.2.2shRNA模板的制备参考大鼠的CX3CL1序列，设计PCR 引物扩增相应的干扰序列。靶序列为GGAGACAAACCC-AGTTCAT，正义链模板的5’端添加了 GATCC，与BomHI酶 切后形成的粘端互补，反义链模板的5’端添加了 AATTC，与 £C〇/?l酶切后形成的粘端互补。
GAGATGAACTGGGTTTGTCTCCTTTTTTG；反义链序歹I J : AATTCAAAAAAGGAGACAAACCCAGTTCATCTCGAGAT GAA CT GGGTTTGTCTCCG。取正义链
和反义链〇lig〇溶液，进行退火反应。反应条件:95°C 5 min;85'C 5 min;75-C 5 min; 70°C5 min;4'C保存。退火处理后得到浓度为10 (xM的shRNA 模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200 nM，用于连接 反应。
1.2.3连接反应及转化 将载体PL V X-sh R N A2的线性化的酶切产物与shRNA模板进行定向连接，反应条件:22°C连接 lh。再将连接产物转化细菌感受态细胞，用质粒小提试剂盒抽 提质粒并做鉴定。
1.2.4重组质粒的鉴定将抽提好的质粒进行A T w I单酶切鉴 定，酶切37C,l h后电泳，应该切出来大小约为6500b p和 1350bp的两条带。取200 (xL阳性克隆对应的菌液送测序，并 将剩余的菌液用甘油保存。将测序结果与目的基因序列进行比 对，正解无误后用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量 质粒抽提，得到足够量的重组质粒。
1.3CX3CL1基因干扰慢病毒包装纯化
1.3.1慢病毒载体系统本实验采用的病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pLVX-shRNA2-CX3CLl,psPAX2,pMD
2.G。其 中穿梭质粒pLVX-shRNA2-CX3C L l上携带有U6转录干扰序 列，且能表达绿荧光蛋白筛选标记基因;psPAX2,pMD2.G含 有病毒包装所必须的元件。
1.3.2慢病毒生产取两个离心管分别进行三质粒及转染试剂NDE3000的稀释，分别稀释至500 jxX，室温静置5分钟，将 转染试剂管中的混合液加人到质粒的管中，充分混匀后室温静 置15 min，用1mL头来回吹打3次后均匀加人到293T细 胞中，十字交叉法或八字法充分摇匀后将细胞放回培养箱中继 续培养。转染后16-24 h更换为完全培养基，继续培养48h，第 一次收集全部富含慢病毒颗粒的细胞上清液，往培养基中添加 新鲜完全培养基继续培养24h，第二次收集全部富含慢病毒颗 粒的细胞上清液；，然后收集全部富含慢病毒颗粒的细胞上清 液。使用密理博Amicon Ultra-15 lOOKDa对病毒上清液进行超 滤浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。最后使用逐孔稀释滴度 测定法对病毒进行滴度测定，通过荧光显微镜或FACS计数荧 光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
1.4大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定
采用密度梯度离心法行大鼠间充质干细胞的分离培养，1: 2传代(接种密度lxlOVcm2)，其后一般3-5d传代1次，选取生 长良好的第三代细胞进行后续实验。通过流式细胞仪检测 BMSCs细胞表面标记 CD29、CD31、CD44、CD45。
1.5CX3CL1干扰慢病毒感染BMSCs细胞
实验分为两组为BMSCs+空载组和BMSCS+干扰组。收 集大鼠BMSCs细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为lx 105/mL，每孔500 jxL细胞悬液，进行病毒感染时细胞的融合度 约为70%左右。取出4-
C保存的病毒，使用瞬时离心机离心20 秒，使病毒完全悬于离心管底部即可。吸取病毒液加人细胞中，同时加人5 (xg/mL的Polybrene助转染试剂，以提高感染效率。感染48~72h后，荧光显微镜观察荧光表达情况，估计慢病毒感 染目的细胞的效率。同时收集样本进行后续实验检测。
1.6 QPCR验证目的基因CX3CL1的干扰情况
1.6.1荧光定量PCR提取被空载组及干扰组感染的BMSCs 细胞的RNA，用随机引物反转录成cDNA，反应条件:25°C10 分钟、42t：50分钟、85°C5分钟。参考CX3CL1ID89808序列，然后设计特异性的引物和sybr green I荧光染料进行荣光定量 PCR检测 0弓| *S:rCx3cllFATGGTGGCAAGTTTGA-GAAGC,rCx3cllR TCCTGGGA AATAGCAGTCGG；rat actin fCCCATCTATGAGGGTTACGC'rat actin rTTTAATGTCACG -
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CACGATTTC ，扩增产物分别为145bp 和150bp 。荧光定量
PCR 反应条件:W C 4分钟、94°C 20秒、60°C 30秒、72C 30秒循
环35次，72°C 检测信号。SYBR Green 丨是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料，其与双链DNA 结合后，荧光大大增强。 随着扩增循环数的增加，荧光信号不断积累，因此，SYBR
Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧
光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
1.6.2统计分析所有原始数据核对后采用SPSS16.0软件进
行统计学分析。通过单因素方差分析(One-way A N 0V E 检验） 来说明BM SCs 组、B M SC s+空载组及BM SCs+干扰组这三组 细胞CX3C Llm R NA 的相对表达量(2(^)之间的差异,P<0.05 为具有显著性差异。
2结果
用甘油保存。将测序结果与目的基因序列进行比对，序列完全 一致(图2)。
2.1重组质粒酶切鉴定
限制性内切酶I 酶切位点在载体上有一个，干扰序列 也存在一个，故能切出来大小约为6500bp 和1350bp 的两条 带，如酶切图所示（图1)，能获得与预期结果相一致的DNA 片
周干峙
图1 I.重组质粒;2.重组质粒的酶切鉴定;M:Marker5000
Fig. 1 1 .Recombinant plasmid; 2. Identification of recombinant plasmid
digestion; M:Marker 5000
图2重组质粒的测序结果
Fig. 2 The sequencing results of recombinant plasmid
2.3 pLVX-shRNA2-CX3CLl 及阴性对照慢病毒滴度检测结果
空载体阴性对照及pLVX-shRNA2- CX3CL1病毒浓度的检测结果分别为6x10叮U/mL 、5xlOsTU/mL (图3、图4)，病毒 侵染时间均为72h 。
2.4 BM SCs 细胞分离培养（图5)
骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴 壁生长，细胞呈圆形、梭形、5角形生长缓慢。换液后细胞增殖 明显，出现以梭形为主的多种形态，10天左右70%-80%可融合 达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细 胞融合时呈漩涡状和放射状排列，选取生长良好的第三代细胞 进行实验。图5为100X 的各代细胞图片。2.5 BM SCs 细胞的鉴定
流式细胞仪检测BM SC s 细胞表面标记，结果提示C D 29、 C D 44表达阳性，C D 31、C D 45表达阴性，说明第三代BMSCs
高表达抗原C D 29、C D 44，基本不表达C D31、C D 34，符合BM- S C s 细胞表面标志物的特征〜。图6结果解析:Q 1-U L 代表 CD31+的细胞，Q 卜U R 代表C D 29TD 31+共同标记上的细胞，
Q1-LR 为C D 29，细胞，Q 1-LL 为未被标记的细胞。图7结果
解析:Q 卜U L 代表CD45*的细胞,Q 1-U R 代表CD44X ：D45+共 同标记上的细胞.Q 1-L R 为CD44+的细胞,Q 1-L L 为未被标记段，两者中间出现一条杂带是未完全切割。2.2重组质粒测鉴定
取200 j j l L 阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液
的细胞。
2.6 CX3CL1干扰慢病毒感染的BM SCs 细胞及感染空载体的 BM SCs 细胞的荧光图片
Titer test
l 〇-'
10.2
1〇3
i 〇-4
_
國■
Test result
6xlOs TU/mL
图3阴性对照检测结果
Fig. 3 Test results o
f negative control
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Fig. 8 BMSC+empty vector group
病毒表达绿荧光蛋白，带绿荧光的为感染上的目的细续实验(图8、图9(100X ))。 胞，通过白光和荧光照片比对，感染效率在90%以上，可用于后
Titer test
i 〇-'
i 〇-：
10'3
l 〇-4
m
mam
■■
Test result
5x l 〇8TU/mL
图 4 pLVX-shRNA2- CX3CL1 的检测结果
Fig. 4 Test results of pLVX-shRNA2- CX3CL1 plasmid
24 hours fluid chang Cultured 3 days Fir 图5 BMSCs 形态
Fig. 5 BMSCs shapt
湿地公园规划设计：Q 1-UL(0.18%L
i
Q 1-UR(3.05%)
森
::
1
1 Q 1-LL(8 45%:i * i 11111n | t
B R H R F ''
w W -Q 1-LR (88 31%)
0 104 105
106 107
CD29 PE-A
图6C D 29、C D 3l 双标流式结果
6 Flow cytometry results o f CD29 and CD31
图8 BMSC +空载组
ration cells Third generation cells
Q 1-U L(0 15%)Q 1-UR(2.63%)
Q 1-LL(6 69%)i i i i i r m n t —
•
'泰
:■ Q 1-LR (90 53%)
104 105 106
CD44 PE-A
107图7 CD44、C D 45双标流式结果
Fig. 7 Flow cytometry results of CD44 and CD45
r
t c A t 卜 C H
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南京大报恩寺
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现^^物医学^&^ biomedjournals Progress in Modern Biomedicine V〇L20 NO^l NOV.2020•4011 •
图9 BMSC+干扰组
Fig. 9 BMSC+ interference group
P<0.0001
N S P<0.0001
图10三组BMSCs CX3CLlmRNA相对表达量的单因素方差分析
Fig. 10 One-way ANOVE o f three groups o f BMSCs CX3CL1 mRNA
relative expression
2.7 QPCR检测BMSCs细胞CX3CLlmRNA的表达情况
抽象函数
根据统计结果可见（图i〇)，与阴性对照组（空载体）比较，BMSCs组的CX3CLlmRNA表达是无明显差异，而BM-SCs+干扰组的CX3CLlmRNA表达明显降低，其干扰效率在 70%以上。
3讨论
近年，很多研究发现MSC体外可以调控小胶质细胞表型 转化。培养实验发现人骨髓间充质干细胞(hBMSC)可以抑制 LPS刺激时原代小鼠小胶质细胞的激活，同时下调M l型标记 炎性因子TNF-a、iNOS的表达％研究还发现静脉移植MSC 可降低MCAO小鼠缺血周围区域小胶质细胞TGF-p的表达，下调的TGF-(3降低了星状胶质细胞PA1-1的表达，间接增强 了tPA的活性，从而促进神经修复M。以上研究结果表明MSC 可影响小胶质细胞的作用，但具体机制尚不明确。据文献报道，CX3CL1可能参与了 MSC对小胶质细胞的调控。那么，脑缺血 时MSC能否通过分泌CX3CL1影响促炎型、抗炎型小胶质细 胞在局部脑组织缺血区的分布，从而调控炎症反应，减轻缺血 脑组织损伤，促进神经修复尚不十分清楚。因此我们推测，MSC可能是通过分泌CX3CL1影响缺血性脑卒中小胶质细胞 表型和功能的转化，从而减轻缺血后的炎症反应。本实验选择 密度梯度离心法行大鼠BMSCs的分离培养，并对细胞进行鉴 定证实其可以用于后续实验。以CX3CL1为作用粑点，建立以 慢病毒为载体的RNA干扰体系，然后将慢病毒感染BMSCs，实现高效抑制BMSCs细胞CX3CL1基因的表达。
BMSCs构成骨髓中的非造血细胞体，处于未分化状态，含量极低，但自我更新及增殖能力强，可在
体外进行培养扩增，且自体移植不会发生免疫排斥反应。本实验采用密度梯度离心 法，用3周龄S D大鼠的股骨和胚骨的骨髓进行原代分离培 养116]。培养的BMSCs第三代细胞形态稳定，细胞活性较高，再 次传代后逐渐表现出细胞老化迹象，故进一步实验可选用第三 代的BMSCs。从骨髓中提取的BMSCs混杂了许多细胞，即便细胞来源一致，但无法明确BMSCs所占比例即细胞的纯度，因此非常有必要对BMSCs做鉴定。目前，BMSCs的鉴定主要 包括形态学特征、表面抗原、超微结构及多向分化能力等的检 验[|\BMSCs是一种贴壁生长的细胞，形态为长梭形，并且具 有很强的增殖能力[181。现在许多研究报道，BMSCs可以表达多 种表面抗原，但没有特异性，目前认为CD29、CD44是BMSCs 的重要抗原标志，CD31、CD45是骨髓造血干细胞的表面抗原[|9#。本实验通过流式细胞仪对培养的第三代BMSCs进行 检测，结果提示CD29和CD44高表达，基本不表达CD31和 CD45，其符合BMSCs的表面标志物特征，说明培养的BMSCs 可用于后续试验。
RNAi技术是近些年发展起来的特异、高效、易操作的基因 阻断技术，是通过抑制目的基因的转录或翻译而实现抑制该基 因的表达。当细胞导人这种shRNA时，该目的基因的mRNA 就会发生降解而导致基因的表达沉默™。RNAi具备高特异性、高效性及内在生物学反应，因此已被广泛用于全基因组筛选、功能基因组学研究、生物技术研究及医学研究等[22气RNAi的 关键是选择比较合适的载体使双链RNA进人宿主细胞，常用 的载体系统有病毒载体和非病毒载体。病毒载体是近些年来研 究的热点，具有低毒、高效等优点，主要括慢病毒载体、逆转录 病毒载体、腺病毒载体等。目前广泛应用的是慢
病毒载体，具有 操作技术成熟并能够实现高效转染，对于分裂和不分裂的细胞 均有感染性，且能够长期稳定表达病毒基因等优点％261。因此本 实验采用慢病毒载体作为实施RNAi的工具，对目的基因 CX3CL1进行了高效特异性的抑制。根据PCR及测序的结果 判断，靶向基因的shRNA与载体pLVX-shRNA2连接情况符 合预期设计，且通过高效的病毒包装系统得到了高滴度(5-6x lOTU/mL)的慢病毒颗粒。然后将慢病毒感染BMSCs，使 BMSCs的CXCL1得到了显著的沉默，为后续研究CX3CL1的
作用机制奠定了基础。
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