动物医学进展，２０２０，４１（１２）：１７ ２２
ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
猪胸膜肺炎放线杆菌及血清１、３、５、７型多重ＰＣＲ检测方法 的建立及应用
孙学飞１，２，谭业平１，王丹丹１，周俊明１，祝昊丹１，吕立新１，俞正玉１，何孔旺１，
李 彬１，温立斌１，张雪寒１，倪艳秀１
mla
（１．江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京２１００１４；２．上海百立生物科技有限公司，上海２０１４０２）
摘 要：针对猪胸膜肺炎放线杆菌种特异性基因犃狆狓Ⅳ和血清１、３、５、７型的特异犆狆狊基因设计５对引物，通过扩增条件的优化，建立了猪胸膜肺炎放线杆菌及血清１、３、５、７型的五重ＰＣＲ检测方法。特异性试验显示，对血清１～１５型参考菌株均扩增出相应的预期目的条带，对６种引起猪发病的主要病原菌均未扩增出任何条带。敏感性试验表明，对各血清型细菌纯培物的敏感性皆为１０３ＣＦＵ／ｍＬ；对１、５型感染样品的敏感性为１０４ＣＦＵ／ｇ，对３、７型感染样品 的敏感性为１０３ＣＦＵ／ｇ。可在４．５ｈ左右直接从病猪肺脏中得到检测结果。方法的建立为相关临床病例快速诊断及流行病学调查提供了有效的技术支持。
关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；血清１，３，５和７型；多重ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ８５２．６１９；Ｓ８２８．９文献标识码：Ａ文章编号：１００７ ５０３８（２０２０）１２ ００１７ ０６
猪传染性胸膜肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｐｌｅｕｒｏ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＰＣＰ）是由胸膜肺炎放线杆菌（犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲，ＡＰＰ）引起的一种高度传染性、致死性呼吸道疾病，以急性出血和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎病变为主要特征。自１９５７年由Ｐａｔｔｉｓｏｎ等首次报道以来［１］，该病已遍布在全世界大多数养猪国家，对养猪业造成巨大损失。我国也于２０世纪８０年代报道由国外进口种猪传入［２］，根据血清学和病原学调查，该病在我国各地猪中普遍存在，而且近年来有发生加剧的趋势［３］。
收稿日期：２０２０ ０１ ０８
基金项目：国家重点研发计划（２０１８ＹＦＤ０５００１０１）；江苏现代农业生猪产业技术体系［ＪＡＴＳ（２０１８）２５９］；公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０３４ ８）
作者简介：孙学飞（１９９０－），男，江苏南京人，硕士，主要从事动物传染病研究。 通讯作者
櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙犉狌狕狕狔犃狀犪犾狔狋犻犮犪犾犎犻犲狉犪狉犮犺狔犘狉狅犮犲狊狊犅犪狊犲犱犘狅狋犲狀狋犻犪犾 狉犻狊犽犃狊狊犲狊狊犿犲狀狋
犕狅犱犲犾犳狅狉犃犳狉犻犮犪狀犛狑犻狀犲犉犲狏犲狉
ＷＡＮＧＸｉｎ，ＦＥＮＧＰｅｎｇ，ＴＩＡＮＱｉｎｇ ｌｅｉ，ＷＵＭｅｎｇ ｍｅｎｇ，ＳＨＩＬｏｎｇ ｆｅｉ，
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（犃狀犻犿犪犾犇犻狊犲犪狊犲犘狉犲狏犲狀狋犻狅狀犪狀犱犆狅狀狋狉狅犾犆犲狀狋犲狉狅犳犡犻 犪狀，犡犻 犪狀，犛犺犪犪狀狓犻，７１００１８，犆犺犻狀犪）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｆｉｒｓｔＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ（ＡＳＦ）ｏｕｔｂｒｅａｋｉｎＣｈｉｎａｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎｔｈｅｅａｒｌｙＡｕｇｕｓｔｉｎＳｈｅｎｙａｎｇ．Ｐｒｅｓｅｎｔｌｙ，ｔｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｏｆＡＳＦｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｉｓａｌｓｏｇｒｉｍａｎｄｃａｕｓｅｈｕｇｅｂｕｒｄｅｎｔｏＣｈｉｎｅｓｅｐｉ
ｇｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ５ｃｒｉｔｉｃａｌｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓａｎｄ２０ｓｅｃｏｎｄａｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｏｕｒｐｅｒｉｏｄｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｔｈｒｏｕｇｈｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉ ｇａｔｉｏｎｓａｎｄｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｉｓｋａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｍｏｄｅｌｆｏｒＡＳＦｗａｓｅｓｔａｂｌｉｅｄ．Ｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｗｅｉｇｈｔｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｗｉｌｌｆｅｅｄｉｎｇｔｏｐｉｇｓａｎｄｐｉｇｌｏｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎａｒｅｔｈｅｈｉｇｈｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｆｏｒＡＳＦａｎｄｗｈｉｃｈｗｏｕｌｄｂｅｔｈｅｋｅｙｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｉｓｋａｓｓｅｓｓ ｍｅｎｔｍｏｄｅｌｄｅｒｉｖｅｄｈａｚａｒｄｒａｔｅ（Ｙｖａｌｕｅ）ｗｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄａｃｃｕｒａｔｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｆｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｉｓｋｏｆＡＳＦ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ／ｃｏｎｔｒｏｌｇｕｉｄａｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．犓犲狔狑狅狉犱狊：Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ；ｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｉｓｋ；ｒｉｓｋｆａｃｔｏｒ；ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｍｏｄｅｌ
根据荚膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＣＰＳ）和脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＬＰＳ）的抗原性不同，
ＡＰＰ分为１８个血清型（１～１８型）［４ ５］。其中血清５型又分为５ａ和５ｂ２个亚型。大多数血清型之间没有交叉反应。但在血清型３、６、８之间［６］、１与９之间［７］、４与７之间［８］存在交叉反应，这与这些血清型之间ＬＰＳ存在相似性有关。血清型之间交叉反应的存在，为血清学诊断方法带来了一定的难度。尽管属于生物Ⅰ型的血清１～１２型和１５型都能致猪发病或死亡，但不同的血清型之间的毒力有明显差异，能够分泌毒素Ｉ的血清型１、５、９、１０和１１比其他血清型毒力强，可引起的严重的肺部病变和高死亡率，而血清３型和６型的毒力最低。各血清型之间交叉保护低，导致灭活疫苗对ＡＰＰ感染只能提供型特异性保护，甚至同型间有时也不能提供完全的交叉保护［９］。
ＡＰＰ在不同的国家和地区有不同的优势血清型，同一国家在不同的时间也可能有不同的流行血清型。在匈牙利，以２、１３、８和１６型为主［１０］。在澳大利亚，以１、５、７和１５型为主［１１］。在英国，研究表明不管是１９９５年－２００７年之间的分离株还是２００８年－２０１４年之间的分离株都以血清８型为主［１２ １３］。而加拿大在１９８０年－１９９０年之间的分离株以血清１型为主，但近年来（２０１２年－２０１４年）以血清５型和７型为主［１４ １５］。在我国，流行的ＡＰＰ血清型较多，己分离到１、２、３、４、５、７、８、９和１０型，以前报道以
长链二元酸１、３和７型为主，近年来有关血清５型的报道越来越多［１６ １７］。
本研究根据我国ＡＰＰ流行的现状，搜集了国内外文献中刊登的ＡＰＰ血清１、３、５、７型引物并从中
筛选出４对引物以及鉴定ＡＰＰ的ＡｐｘⅣ序列的引物，摸索出一套检测ＡＰＰ及血清１、３、５、７型的多重ＰＣＲ方法并进行初步应用，以期为ＡＰＰ的快速诊断及流行病学调查提供有力的技术支持。 １ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌株 ＡＰＰ血清１～１２、１５型参考菌株、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠埃希菌、猪丹毒杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪沙门菌，均由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存；ＡＰＰ血清１３和１４型参考菌株，由华中农业大学动物医学院周锐教授惠赠。
１．１．２ 主要试剂 ＴＨＢ，美国ＢＤ公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ），南京生兴生物技术有限公司产品；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒，美国ＡＸＹＧＥＮ公司产品；２×犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ，东盛生物科技有限公司产品；ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，南京诺唯赞生
物科技有限公司产品。
１．１．３ 主要仪器 ＰＣＲ仪（ＴＰ６００），日本Ｔａｋａｒａ公司产品；小型高速冷冻离心机（５４１５Ｒ），德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品。
１．２ 方法
１．２．１ 引物的设计与合成 ＡＰＰ种属引物参照［１８］描述方法设计，其靶基因为ＡＰＰ的种特异基因犃狆狓Ⅳ。ＡＰＰ血清１、３、５、７型引物参照文献［１９］描述的方法设计，其靶基因为ＡＰＰ的犆狆狊基因；引物由上海英潍捷基生物有限公司合成，其相关信息见表１。引物用ｄｄＨ
２Ｏ
稀释成１０μｍｏｌ／Ｌ。桂林工学院学报
表１ 多重ＰＣＲ引物
Ｔａｂｌｅ１ ＰｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
引物Ｐｒｉｍｅｒ引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
目的基因
Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ
产物长度／ｂｐ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ
Ｓ１ＦＣＴＧＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＴＴＣＣ犆狆狊１犅９５９Ｓ１ＲＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴＴＧＣＡＴＴＴＴＣ
Ｓ３ＦＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣ犆狆狊９犇′５２０Ｓ３ＲＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧ
Ｓ５ＦＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧ犆狆狊５犅８２５Ｓ５ＲＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣ
Ｓ７ＦＴＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧ犆狆狊２犇６００Ｓ７ＲＣＧＴＣＣＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧ
ＡＰＰＦＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＣＣ犃狆狓Ⅳ４１７ＡＰＰＲＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣ
１．２．２ 细菌基因组ＤＮＡ提取 液体培养物采用常规高温裂解法提取。感染猪肺脏组织按常规用细菌裂解液裂解离心后，取上清作为ＰＣＲ反应模板。
８
１动物医学进展 ２０２０年 第４１卷 第１２期（总第３３０期）
１．２．３ ＰＣＲ扩增及其条件的优化
（１）ＡＰＰ及血清１、３、５、７型单一ＰＣＲ扩增：反应体系２×犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２．５μＬ、超纯水８μＬ、上下游引物各１μＬ、模板ＤＮＡ２．５μＬ。反应参数：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，４５℃～６５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。取１０μＬＰＣＲ产物于２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中进行电泳，然后在紫外检测仪下观察，根据ＰＣＲ扩增产物条带的亮度来确定最佳退火温度。
（２）ＡＰＰ及血清１、３、５、７型多重ＰＣＲ扩增：将ＡＰＰ及血清１、３、５、７型引物进行不同浓度的组合，在最佳退火温度下进行ＰＣＲ，根据电泳结果来确定最佳的引物组合用于多重ＰＣ
Ｒ的扩增。
（３）ＰＣＲ产物的鉴定：采用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒纯化扩增片段，将扩增产物连接Ｔ载体，将阳性质粒送至上海英潍捷基生物有限公司进行序列测定。将所测序列与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的序列进行同源性比对，根据同源性高低来鉴定ＰＣＲ产物的正确性。１．２．４ 多重ＰＣＲ检测方法的特异性试验 提取ＡＰＰ血清１～１５型参考菌株、猪大肠埃希菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪沙门菌基因组ＤＮＡ模板，按优化的多重ＰＣＲ反应条件进行扩增，以判定该方法对其它引起猪发病的主要病原菌的特异性。
化学在生活中的应用
１．２．５ 多重ＰＣＲ检测方法的敏感性试验
（１）对细菌纯培养物检测的敏感性：将细菌的浓度调整至１０８ＣＦＵ／ｍＬ，１０倍梯度稀释至１０２ＣＦＵ／ｍＬ，提取其基因组进行多重ＰＣＲ扩增，以确定多重ＰＣＲ对细菌纯培养物的检测敏感性。
（２）对人工模拟感染样品检测的敏感性：将细菌的浓度调整至１０７ＣＦＵ／ｍＬ，１０倍梯度稀释至１０２ＣＦＵ／ｍＬ，吸取０．２ｍＬ注入２ｇ未感染此病原的猪肺组织，提取其基因组进行多重ＰＣＲ扩增，以确定多重ＰＣＲ对人工模拟感染样品的检测敏感性。１．２．６ 多重ＰＣＲ检测方法的重复性试验 用本研究建立的单一ＰＣＲ方法和多重ＰＣＲ方法对相同的细菌基因组ＤＮＡ模
板在３ｄ内进行３次重复检测，用来确定多重ＰＣＲ的稳定性。
长恨歌赏析１．２．７ 多重ＰＣＲ检测方法的临床应用 对采集的２０份疑似病例同时进行多重ＰＣＲ与细菌分离检测结果的比较。通过对两种方法检测结果的对比，计算其符合率。符合率＝（共同阳性数＋共同阴性数）／所检样品×１００％。
２ 结果
２．１ ＡＰＰ及血清１、３、５、７型单一ＰＣＲ扩增
单一ＰＣＲ产物凝胶电泳检测结果显示，在退火温度为６０℃时，ＡＰＰ及血清１、３、５、７型均无其他非特异性条带，且ＰＣＲ产物条带明亮。因此确定五重ＰＣＲ程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ；６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环；７２℃终延伸７ｍｉｎ。
２．２ ＡＰＰ及血清１、３、５、７型多重ＰＣＲ扩增
将５对引物按不同浓度配比组合后经ＰＣＲ扩增，确定最佳的引物配比为：ＡＰＰ犃狆狓Ⅳ上、下游引物各１μＬ，ＡＰＰ血清１、３、５、７型上、下游引物皆为０．４μＬ，用此引物组合对含有不同ＡＰＰ血清１、３、５、７型模板组合的检测结果见图１。由图１可见，扩增后未出现非特异性条带
且目的条带清晰可见
。
Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．Ｓ１＋Ｓ３；２．Ｓ１＋Ｓ５；３．Ｓ１＋Ｓ７；４．Ｓ３＋Ｓ７；５．Ｓ３＋Ｓ５；６．Ｓ５＋Ｓ７；７．Ｓ１＋Ｓ３＋Ｓ５；８．Ｓ１＋Ｓ３＋Ｓ７；９．Ｓ１＋Ｓ５＋Ｓ７；１０．Ｓ３＋Ｓ５＋Ｓ７；１１．Ｓ１＋Ｓ３＋Ｓ５＋Ｓ７；１２．Ｓ１；１３．Ｓ３；１４．Ｓ５；１５．Ｓ７
Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．Ｓ１＋Ｓ３；２．Ｓ１＋Ｓ５；３．Ｓ１＋Ｓ７；４．Ｓ３＋Ｓ７；５．Ｓ３＋Ｓ５；６．Ｓ５＋Ｓ７；７．Ｓ１＋Ｓ３＋Ｓ５；８．Ｓ１＋Ｓ３＋Ｓ７；９．Ｓ１＋Ｓ５＋Ｓ７；１０．Ｓ３＋Ｓ５＋Ｓ７；１１．Ｓ１＋Ｓ３＋Ｓ５＋Ｓ７；１２．Ｓ１；１３．Ｓ３；１４．Ｓ５；１５．Ｓ７
图１ 多重ＰＣＲ检测方法条件优化结果
Ｆｉｇ．１ ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
pmh９
１孙学飞等：猪胸膜肺炎放线杆菌及血清１、３、５、７型多重ＰＣＲ检测方法的建立及应用
２．３ ＰＣＲ产物的鉴定
将所测的阳性质粒序列与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的序列进行同源性比对，结果表明，ＰＣＲ扩增片段均为相应的目的基因片段。
２．４ 多重ＰＣＲ检测方法的特异性试验
用所建立的多重ＰＣＲ方法检测ＡＰＰ血清１、３、５、７型的基因组ＤＮＡ，在相应大小的位置均有特异ＰＣＲ条带，对ＡＰＰ血清１～１５型均可以扩增出４１７ｂｐ大小的条带（图２）。而对引起猪发病的主要病原菌（猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠埃希菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪丹毒杆菌、猪沙门菌）基因组ＤＮＡ模板均无任何扩增产物（图３），结果表明所建立多重ＰＣＲ方法具有良好的特异性
。
Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．Ｓ１；２．Ｓ２；３．Ｓ３；４．Ｓ４；５．Ｓ５Ａ；６．Ｓ５Ｂ；７．Ｓ６；８．Ｓ７；９．Ｓ８；１０．Ｓ９；１１．Ｓ１０；１２．Ｓ１１；１３．Ｓ１２；１４．Ｓ１３；１５．Ｓ１４；１６．Ｓ１５
Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．Ｓ１；２．Ｓ２；３．Ｓ３；４．Ｓ４；５．Ｓ５Ａ；６．Ｓ５Ｂ；７．Ｓ６；８．Ｓ７；９．Ｓ８；１０．Ｓ９；１１．Ｓ１０；１２．Ｓ１１；１３．Ｓ１２；１４．Ｓ１３；１５．Ｓ１４；１６．Ｓ１５
图２ 多重ＰＣＲ对ＡＰＰ各型菌的特异性试验结果
Ｆｉｇ．２ ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｏｎｖａｒｉｏｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅｓｏｆＡＰ
Ｐ
Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．ＡＰＰ血清１、３、５、７型混合模板；２．猪大肠
埃希菌；３．巴氏杆菌；４．猪丹毒杆菌；５．猪链球菌；６．副猪嗜血杆菌；
７．猪沙门菌
Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．ＡＰＰＳ１＋Ｓ３＋Ｓ５＋Ｓ７；２．犈．犮狅犾犻；３．ＰＭ；
４．ＥＲＹ；５．ＳＳ；６．ＨＰＳ；７．ＳＡＬＭ
图３ 多重ＰＣＲ对其它致病菌的特异性试验结果
Ｆｉｇ．３ ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｏｎｏｔｈｅｒｐｏｒｃｉｎｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａ
２．５ 多重ＰＣＲ检测方法对细菌纯培养物的敏感性
将各血清型细菌的浓度调整至１０８ＣＦＵ／ｍＬ，１０
倍梯度稀释后提取其基因组进行多重ＰＣＲ扩增，其
电泳结果见图４，该多重ＰＣＲ对ＡＰＰ血清１、３、５、７
型纯培物的敏感性皆为１０３ＣＦＵ／ｍＬ。
２．６ 多重ＰＣＲ检测方法对人工模拟感染样品的敏
感性
用所建立的多重ＰＣＲ方法不用增菌、直接对人
工模拟感染样品进行检测，整个检测过程约为
４．５ｈ，该多重ＰＣＲ对ＡＰＰ血清１、５型及ＡＰＰ感染
样品的敏感性皆为１０４ＣＦＵ／ｇ，对ＡＰＰ血清３、７型
感染样品的敏感性皆为１０３ＣＦＵ／ｇ。
２．７ 多重ＰＣＲ检测方法的重复性
相同样品３ｄ内分别进行３次的多重ＰＣＲ扩
增与单一ＰＣＲ扩增，结果表明，３次多重ＰＣＲ结果
一致，且与３次单一ＰＣＲ的试验结果完全一致，这
表明所建立的五重ＰＣＲ方法具有良好的重复性。
２．８ 多重ＰＣＲ检测方法的临床应用
对采集的２０份疑似病例同时进行细菌分离鉴
定和本试验建立的多重ＰＣＲ方法的检测。结果表
明，细菌分离血清学鉴定到８株ＡＰＰ，血清１型、
３型、５型和７型各２株；多重ＰＣＲ方法检测到８份
样品犃狆狓Ⅳ阳性，血清１型、３型、５型和７型阳性
各２份，两种方法符合率为１００％。说明所建立的
多重ＰＣＲ方法对ＡＰＰ血清１、３、５、７型的分型检测
是可行的，且与细菌分离检测结果一致。
３ 讨论
猪传染性胸膜肺炎的临床症状与猪链球菌病和
副猪嗜血杆菌病的临床症状极为相似，通过传统的
临床症状观察、病理剖检进行诊断，虽然快速简便，
但只能做出初步判断。而且ＡＰＰ血清型众多，同一
猪场可能同时存在不同的血清型。因其生长对营养
要求较高，细菌分离培养较为困难，周期也较长，其
局限性较大。单一ＰＣＲ方法，虽然特异性高，检测
范围广，但难以应对目前多种病原混合感染的检测。
因此，寻一种适用范围广、高通量、特异性强、灵敏
度高、快速准确的检测方法迫在眉睫［２０］。
０
２动物医学进展 ２０２０年 第４１卷 第１２期（总第３３０期）
ＰＣＲ检测方法受到很多因素的影响，如退火温度、引物的设计及用量等均可影响ＰＣＲ的特异性和敏感性。本试验通过对单一引物及多重引物做温度梯度ＰＣＲ，最终确定５对引物的最佳退火温度为６０℃，在单一ＰＣＲ试验的基础上，通过优化引物浓度组合，最后建立了多重ＰＣＲ检测方法。
细菌纯培
Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．１０８ＣＦＵ／ｍＬ；２．１０７ＣＦＵ／ｍＬ；３．１０６ＣＦＵ／ｍＬ；４．１０５ＣＦＵ／ｍＬ；５．１０４ＣＦＵ／ｍＬ；６．１０３ＣＦＵ／ｍＬ；
７．１０２ＣＦＵ／ｍＬ；８．１０１ＣＦＵ／ｍＬ；Ａ．ＡＰＰＳ１；Ｂ．ＡＰＰＳ３；Ｃ．ＡＰＰＳ５；Ｄ．ＡＰＰＳ７
Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．１０８ＣＦＵ／ｍＬ；２．１０７ＣＦＵ／ｍＬ；３．１０６ＣＦＵ／ｍＬ；４．１０５ＣＦＵ／ｍＬ；５．１０４ＣＦＵ／ｍＬ；６．１０３ＣＦＵ／ｍＬ；
７．１０２ＣＦＵ／ｍＬ；８．１０１ＣＦＵ／ｍＬ；Ａ．ＡＰＰＳ１；Ｂ．ＡＰＰＳ３；Ｃ．ＡＰＰＳ５；Ｄ．ＡＰＰＳ７
图４ 多重ＰＣＲ敏感性检测结果
Ｆｉｇ．４ ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
养的敏感性试验结果表明，本法能够检测ＡＰＰ及
ＡＰＰ血清１、３、５、７型细菌基因组ＤＮＡ最低浓度皆
为１０３ＣＦＵ／ｍＬ，说明本ＰＣＲ方法有较高的敏感
性。应用本多重ＰＣＲ法对其他常见的猪病病原体
进行检测，结果均无扩增产物，证明该方法具有较高
的特异性。本多重ＰＣＲ方法从细菌培养物中ＤＮＡ
提取、ＰＣＲ扩增到琼脂糖凝胶电泳检测，整个过程
仅需３ｈ左右，从肺脏病料中可不增菌，直接提取
ＤＮＡ进行检测，整个过程仅需４．５ｈ左右。
总之，本研究所建立的多重ＰＣＲ方法可同时检
测ＡＰＰ及对主要优势血清型１、３、５、７型进行分型
检测，敏感性高，特异性强，重复性好，检测速度快，
大大提高了效率。这为动物及动物产品ＡＰＰ的流
行病学调查及疫情病原检测提供了技术支撑，可为
猪传染性胸膜肺炎的预防控制提供科学依据。
参考文献：
［１］ ＰＡＴＴＩＳＯＮＩＨ，ＨＯＷＥＬＬＤＧ，ＥＬＬＩＯＴＪ．Ａ犎犪犲犿狅狆犺犻犾狌狊
ｌｉｋｅｏｒｇａｎｉｓｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐｉｇｌｕｎｇａｎｄｔｈｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｎｅｕ
ｍｏｎｉｃｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪＣｏｍｐＰａｔｈｏｌ，１９５７，６７（０４）：３２０ ３３０．
［２］ 杨旭夫，彭发泉．胸膜肺炎嗜血杆菌的分离和鉴定［Ｊ］．中国畜
禽传染病，１９９０，５３（０４）：１ ３
［３］ ＺＨＡＮＧＢＺ，ＫＵＸＧ，ＹＵＸＸ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅｐｉｇ
ｆａｒｍｓｆｒｏｍ２０１３ｔｏ２０１７［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１９，９（０１）：９９０８．
［４］ ＳＡＲＫＯＺＩＲ，ＭＡＫＲＡＩＬ，ＦＯＤＯＲＬ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｐｒｏ
ｐｏｓｅｄｎｅｗｓｅｒｏｖａｒｏｆ犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲：Ｓｅｒｏ
ｖａｒ１６［Ｊ］．ＡｃｔａＶｅｔＨｕｎ，２０１５，６３（０４）：４４４ ４５０．
［５］ ＢＯＳＳ?ＪＴ，ＬＩＹ，Ｓ?ＲＫ?ＺＩＲ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｐｏｓａｌｏｆｓｅｒｏｖａｒｓ１７
ａｎｄ１８ｏｆ犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲ｂａｓｅｄｏｎｓｅｒｏｌｏｇｉ
ｃａｌａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１８，２１７：１ ６．
［６］ ＮＩＥＬＳＥＮＲ．犎犪犲犿狅狆犺犻犾狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲（犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊
狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲）．Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ８，３ａｎｄ６．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅ
ａｎｄｃｒｏｓｓｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｐｉｇｓ［Ｊ］．ＮｏｒｄＶｅｔＭｅｄ，１９８５，３７（４）：
２１７ ２２７．
［７］ ＭＩＴＴＡＬＫＲ．Ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎ犃犮狋犻狅狀犫犪犮犻犾犾狌狊（犎犪犲
犿狅狆犺犻犾狌狊）狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲ｓｔｒａｉｎｓｏｆｓｅｒｏｔｙｐｅｓ１ａｎｄ９［Ｊ］．
ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９０，２８（３）：５３５ ５３９．
［８］ ＭＩＴＴＡＬＫＲ，ＢＯＵＲＤＯＮＳ．Ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｎｔｉｇｅｎｉｃ
ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｍｏｎｇ犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲ｓｔｒａｉｎｓ
ｏｆｓｅｒｏｔｙｐｅｓ４ａｎｄ７［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，２９（７）：１３４４
１３４７．
［９］ ＨＡＥＳＥＢＲＯＵＣＫＦ，ＣＨＩＥＲＳＫ，ＶＡＮＯＶＥＲＢＥＫＥＩ，ｅｔａｌ．
犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｐｉｇｓ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ，１９９７，５８（２ ４）：２３９ ２４９．
［１０］ Ｓ?ＲＫ?ＺＩＲ，ＭＡＫＲＡＩＬ，ＦＯＤＯＲＬ．犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犲狌狉狅
狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲ｓｅｒｏｔｙｐｅｓｉｎＨｕｎｇａｒｙ［Ｊ］．ＡｃｔａＶｅｔＨｕｎｇ，２０１８，
６６（３）：３４３ ３４９．
［１１］ ＹＥＥＳ，ＢＬＡＣＫＡＬＬＰＪ，ＴＵＲＮＩＣ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄ
１
２孙学飞等：猪胸膜肺炎放线杆菌及血清１、３、５、７型多重ＰＣＲ检测方法的建立及应用
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