张涵;鲁会军;金宁一;解长占;李太元;哈卓;李卓昕;李成辉;李金凤;赵冠宇;郭影成
【摘 要】从东北地区采集的150份猪肺脏样品中,检测出3株猪细小病毒毒株.根据PPV7标准株NCBI登录号KU563733设计3对引物,对3个病毒株的基因片段进行扩增测序,将测序结果依次进行拼接,获得3个病毒株的NS1和CP基因序列,然后进行序列的同源性比对及进化树分析.结果显示:3个毒株的NS1基因序列与经典PPV7毒株的同源性分别为94.4％～95.2％、94.1％～95.1％和93.5％～94.3‰CP基因序列与经典PPV7毒株的同源性分别为89.6％～91.8％、89.8％～92.0％和89.6％～91.7％.通过进化树比对分析,确认3株PPV毒株为PPV7亚型.通过对其他病毒进行检测,发现PPV7与PCV2、PPV2的混合感染率较高.该分析结果为我国东北地区猪病防控提供了依据. 安塞县高级中学【期刊名称】《中国动物检疫》
【年(卷),期】2018(035)011
【总页数】4页(P71-74)
【关键词】江汉油田猪细小病毒7型(PPV7);基因组测定;遗传进化分析
【作 者】张涵;鲁会军;金宁一;解长占;李太元;哈卓;李卓昕;李成辉;李金凤;赵冠宇;郭影成
【作者单位】军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;延边大学农学院,吉林延边133002;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;延边大学农学院,吉林延边133002;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;延边大学农学院,吉林延边133002;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;延边大学农学院,吉林延边133002;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;吉林大学动物医学学院,吉林长春130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130122;吉林大学动物医学学院,吉林长春130062;吉林市丰满区动物疫病预防控制中心,吉林吉林 132013
【正文语种】中 文
psc【中图分类】S852.65
猪细小病毒（PPV）是一种小型的、非包膜的、单链DNA病毒。猪细小病毒病是由PPV引起的一种猪繁殖障碍病，主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，会产出畸形胎、死胎或木乃伊胎，特别是初产母猪，但母猪本身无明显症状[1]。细小病毒包括细小病毒亚科和浓病毒亚科两个子科。细小病毒亚科病毒感染脊椎动物，又被进一步划分为细小病毒属、红病毒属和依赖病毒属；浓病毒亚科病毒感染节肢动物，下设浓病毒属、艾特拉病毒属和康特拉病毒属3个病毒属。PPV隶属于细小病毒科细小病毒属。
目前除经典PPV（称为PPV1）外，又陆续发现了一些新的细小病毒[2-3]。虽然到目前为止，已经确定了7个PPV基因型（PPV1—PPV7），但对新发现细小病毒的理化特性、传播途径及致病性研究甚少。猪细小病毒7型（Porcine parvovirus 7，PPV7）是2016年Palinski等[4]利用宏基因组测序技术，在美国猪肛门拭子中发现的一种新的细小病毒。然而，在全球猪中，PPV7的临床体征和分布仍有待确定。PPV7基因全长为4 103 bp，包括2个开放阅读框（ORF）：左侧ORF1编码非结构蛋白（NS1），右侧ORF2编码结构蛋白（Cap）。目前只有我国和美国有过PPV7相关报道[5-6]。
本研究从东北地区采集150个样品，从中检测得到的3个病毒株，并对其进行NS1和CP基因
序列测序，并与GenBank中登录经典毒株的NS1和CP基因序列进行同源性比对和进化树分析，以确定这3个病毒株的PPV亚型，同时测定与其他病毒的共感染情况。
1 材料与方法
虚云1.1 材料
1.1.1 样品 在东北地区某些猪场，采集肺脏样品150份：黑龙江省肇州县15份，辽宁省沈阳市15份，辽宁省大连市15份，黑龙江省巴彦县15份，吉林省乾安县30份，黑龙江省天佑公司30份；吉林省吉林市丰满区30份。
1.1.2 主要试剂 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒等：购自天根生化科技有限公 司；DL2000核 酸Marker： 购 自TaKaRa公司；TransStart Fastpfu Fly DNA Polymerase、5×TransStart Fastpfu Fly Buffer、Trans1-T1：购自全式金公司；pClone 007 Blunt Vector、10×Topo Mix： 购 自TSINKE公 司；AxyPrep质 粒DNA小量试剂盒：购自AXYGEN；琼脂糖：购自invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参考NCBI登录号KU563733全基因序列，应用Primer Permier 5.0软件，设计3对特异性引物。引物由库美生物有限公司合成（表1）。
表1 根据NCBI中PPV7KU563733设计的引物名称 引物序列（5′—3′） 大小/bp产物长度/bp PPV7检测引物引物上游：ACTGCTTTTGCTTTCGCTTTAGA下游：CTTGCCATTGTTGCATGTTTAGG 135～225 91 PPV7-1F 417～1 736 1 320上游：AGCGGGTTCACGGTGGCTAATGCTCTGGG下游：TGATGGGTGTACTCGGCAGGT PPV7-2F 1 527～3 136 1 610上游：GGGGACTGAGACAGCTCGTCAACTGCGGCGAG下游：TTGTGCCTGCTGTCGGATACG PPV7-3F 3 115～4 013 899上游：CCGTATCCAACAGCAGCCACAACCTGGCCACA下游：TGGCGTTGAGAAGACACTGGATTAG
1.2.2 病料核酸（DNA）提取 将病料组织液，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，再将产物（DNA）置于-20 ℃保存备用。
1.2.3 阳性样品检测 用PPV7检测引物，对上述产物（DNA）进行PCR检测。PCR体系为25 μL：ddH2O 14 μL、dNTP 5 μL、Fly Buffer 2.5 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、
Fly 酶 0.5 μL、DNA 样品1 μL。PCR反应体系为：95 ℃预变性2 min、95℃变性 20 s、53 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s、72 ℃再延伸10 min；35个循环。取10 μL PCR产物，用1.2%琼脂糖凝胶跑电泳后进行观察。在大小对应位置有条带的疑似为阳性样品。
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1.2.4 目的基因分段扩增 将上述疑似的阳性样品进行PCR分段扩增。PCR扩增体系为25 μL：ddH2O 14 μL、dNTP 5 μL、Fly Buffer 2.5 μL、 上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、Fly 酶 0.5 μL、DNA样品1 μL。PCR反应体系为：95 ℃预变性2 min、95 ℃变性20 s、退火30 s（每对引物有对应的退火温度）、72 ℃延伸30 s、72 ℃再延伸10 min；35个循环。取10 μL PCR产物，用1.2%琼脂糖凝胶跑电泳后进行观察。
1.2.5 基因的克隆、测序 从琼脂糖凝胶中，切回大小正确的条带进行胶回收；将目的条带连接到pCLone 007 Blunt vector上，连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞；挑取单个菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养约12 h。用小提试剂盒提取质粒，送库美生物工程有限公司进行测序。
1.2.6 序列比对与分析 根据各片段之间相互重叠的部分，用DNAMAN 6.0将测序成功的各片段依次拼接，获得完整的全基因序列；采用DNASTAR 7.1和MEGA 5.2 等软件，将其与
GenBank中发表的流行毒株的基因序列及对应的氨基酸序列进行同源性对比分析，并构建进化树，分析所检测毒株的遗传变异特征。
1.2.7 混合感染检测 在150 个肺脏样品中，先检测PPV7阳性个数，再检测PPV7阳性样品中感染其他病毒包括猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细环病毒（TTSUV）、PPV2、PPV3、PPV4、PPV6的个数，之后计算共感染率。
2 结果与分析
2.1 PCR检测与基因片段扩增
对150 份肺脏样品进行PCR检测，检出PPV7阳性样品31份，阳性率为20.7%；将阳性样品DNA进行PCR扩增，发现有3个病毒株的片段与预期片段大小基本一致（图1），其他阳性样品因结构特殊，不能完成测定。
2.2 NS1和CP基因测序
广州视窗网将测序结果拼接后获得NS1和CP基因序列：3个毒株的NS1基因序列大小分别为2 019、2
020和2 019 bp，CP基因序列大小均为1 409 bp。3个病毒株分别命名为PPV7-China/DB2018-5、PPV7-China/DB2018-13和 PPV7-China/DB2018-5-71。
2.3 NS1和CP基因同源性比对和进化树分析
图1 3个毒株的3个基因片段的PCR扩增结果M.DL2 000 bp DNA Marker；1～3.5-1F、5-2F、5-3F 片段；4～6.13-1F、13-2F、.13-3F 片段；7～9.71-1F、71-2F、71-3F 片段
同源性比对和进化树分析显示：这3个毒株与GenBank收录的PPV7毒株KU563733、KY996756、KY996757、KY996758的 NS1同源 性 分 别 为 94.4%～95.2%、94.1%～95.1% 和93.5%～94.3%，CP同源性分别为89.6%～91.8%、89.8%～92.0%和89.6%～91.7%。通过进化树比对分析，确认3株PPV毒株为PPV7亚型（图2～图5）2.4 混合感染检测
图2 鉴定毒株与经典PPV7毒株NS1同源性比对结果
图3 鉴定毒株与经典PPV7毒株NS1进化树
图4 鉴定毒株与经典PPV7毒株的CP同源性比对结果
图5 鉴定毒株与经典PPV7毒株CP进化树
混合感染检测结果显示，对检出的31份PPV7阳性样品进行其他7种病毒检测，发现PPV7 与其他病毒的混合感染情况较为普遍，与上述7种病毒均有混合感染，其中与PCV2和PPV2的共感染率较高，分别为58.0%和61.3%（图6）。结果提示，需要加强对东北地区多种病毒混合感染的控制，尤其是PPV7与PCV2、PPV2混合感染的控制。
3 结论
本研究对从东北地区检测出的3个PPV病毒株的NS1和CP基因序列，与PPV7经典毒株序列进行同源性比对和分析，证实该3个病毒株为PPV7亚型，同时发现PPV7与PCV2、PPV2的混合感染率较高。这为东北地区防控PPV7提供了参考，并丰富了我国PPV7分子流行病学资料。
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