doi: 10.7541/2021.2019.249
阎德平1
吕建建1, 2
陆 璇1
张 文1
题兴斌1
捷克煤矿爆炸宋 柳1
刘 萍
1, 2
(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛 266071;
2. 青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 青岛 266071)
摘要: 为明确三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus )DNA 损伤诱导蛋白因子-4(DNA Damage Inducible Transcript like 4, DDIT4L)基因的结构和功能。利用RACE 方法克隆获得三疣梭子蟹Pt -ditt4l 基因全长。该基因序列全长2727 bp, 其中ORF 为507 bp, 编码了一个168个氨基酸的蛋白, 预测分子质量为19.14 kD, 且在C 端有一个高度保守的RTP801_C 结构域。Blast 相似性比对和系统进化树分析发现, Pt-ddit4l 与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei )ddit4l 基因的相似性最高为60%, 且与凡纳滨对虾先聚为一支。梭子蟹不同发育阶段表达分析表明,Pt-ddit4l 基因在发育早期发挥了一定的作用; 组织表达分析显示, Pt-ddit4l 基因在肝胰腺中的表达量最高, 在血细胞中表达量最低。注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus )后的感染实验表明, 血细胞中Pt-ddit4l 的表达量先上升后下降, 在24h 达到峰值, 为对照组的8.85倍(P <0.05); 而肝胰腺中则是整体呈下调的趋势, 在72h 时达到最低值, 仅为对照组的1/40(P <0.05)。注射dsddit4l 后该基因12—24h 表达量显著下调, 且注射dsddit4l 后再进行弧菌感染的螃蟹的死亡率要显著远高于对照组。研究丰富了三疣梭子蟹DNA
损伤诱导蛋白相关研究资料。关键词: 三疣梭子蟹; Pt-ddit4l ; 发育; RNA 干扰; 副溶血弧菌
中图分类号: S968.25; Q786 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2021)02-0334-07
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus )是一种重要的海洋经济动物, 因其肉味鲜美, 蛋白含量高, 已成为我国沿海地区的主要养殖蟹类, 在黄渤海及东
海区域养殖尤为广泛[1, 2]
。随着养殖规模的不断扩大, 病害爆发愈加频繁, 给梭子蟹养殖业造成了巨大的经济损失。而副溶血弧菌(Vibrio parahaemo-lyticus )是造成三疣梭子蟹批量死亡的主要致病菌
之一[3]
。本实验在前期开展的弧菌胁迫全基因组重测序中成功检测并鉴定到一个跟副溶血弧菌性状相关的SNP 标记(P =0.013, 数据未发表), 并成功定位于ditt 4l(DNA damage inducible transcript 4like)基因上, 推测该基因可能是一个具有副溶血弧菌抗性的基因。
DDIT4L 又被称为REDD2/RTP801L, 该基因具
有参与DNA 损伤修复和介导细胞凋亡的功能, 是
DDIT 家族中重要的一员[4, 5]
。该基因首先发现于人的白血病细胞系中, 在相关处理下, 可以使细胞行
使吞噬功能, 随后形成参与免疫反应的巨噬细胞[6]
。ddit4l 基因在哺乳动物的C 端相当保守, 含有一个RTP_901C 蛋白结构域。此外ddit 4l 基因还具有调节胚胎发育、参与无氧代谢及介导细胞凋亡的功能[7—9]。但目前尚未有该基因在甲壳动物免疫防御方面的报道。
为了探究三疣梭子蟹Pt-ddit4l 基因的结构特征和功能, 克隆了三疣梭子蟹Pt-ddit4l 的cDNA 全长，并对不同发育阶段、组织分布、弧菌感染和RNA 干扰下的表达情况进行了深入的研究, 为丰富DDIT 基因家族的功能提供了参考, 也为进一步研
第 45 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报
Vol. 45, No. 2
2021 年 3 月
ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA
修复性牙本质M a r., 2021
收稿日期: 2019-11-14; 修订日期: 2020-05-11
基金项目: 国家虾蟹产业技术体系项目(CARS-48); 国家自然科学基金面上项目(41776160); 山东省重点研发计划(2018GSF121030); 中
央级公益性科研院所基本科研业务费(20603022018027); 江苏省重点研发计划(面上项目, BE2017325)资助 [Supported by the National Shrimp and Crab Industry Technology System (CARS-48); the National Natural Science Foundation of China (41776160); Shandong Province Key Development Program for Research (2018GSF121030); Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute (20603022018027); the Key Research and Development Plan of Jiangsu Province (BE2017325)]作者简介: 阎德平(1995—), 男, 硕士研究生; 主要从事三疣梭子蟹遗传育种工作。E-mail:*****************通信作者: 刘萍, 研究员;E-mail:****************
究三疣梭子蟹在弧菌感染下的免疫防御机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
本实验所使用的三疣梭子蟹均来自中国水产科学研究院黄海水产研究所下营实验基地。2018年8月实验所用梭子蟹均为体重(40±3) g的80日龄个体, 先放置于若干个大整理箱(660 mm×400 mm×310 mm)中暂养1周, 暂养期间持续供氧, 温度保持在23℃, 盐度8.0, pH 8.3, 每晚6点及时更换自然海水和投喂新鲜饵料。
2019年4月在下营实验基地育苗期间, 根据薛俊增等[10]关于三疣梭子幼体发育不同时期的鉴定方法, 在三疣梭子蟹苗种繁育期间采集其幼体发育各期的样品(取3组平行样品), 包括囊胚期、原肠期、眼点期、心跳期、溞状幼体Ⅰ期(Z1)、溞状幼体Ⅱ期(Z2)、溞状幼体Ⅲ期(Z3)、溞状幼体Ⅳ期(Z4)和大眼幼体期(M), 样品放置于液氮中保存[10]。
1.2 病原感染实验
从暂养1周后健康的80日龄梭子蟹中随机取9只, 分别取其肝胰腺、心脏、血细胞、眼柄、鳃、胃、肠和脑等组织样品, 来自3只梭子蟹的同组织样品混合成一管, 置于液氮中保存。随后进行副溶血弧菌感染实验, 参照张杰等[2]实验方法加以改进。将暂养1周后健康的梭子蟹随机分成PBS对照组和副溶血弧菌感染组, 每组50只, 并设置3个平行, 随后分别于三疣梭子蟹游泳足第一关节基膜处注射100 μL的PBS(浓度为10 mm/L)和副溶血弧菌(浓度为3.8×106 cfu/mL)。在注射后的0、3h、6h、12h、24h、48
h和72h收集梭子蟹的血细胞和肝胰腺组织样品, 每组随机取3只。其血细胞的收集方法参照宋柳等[11]进行, 每只于游泳足第一关节基膜处抽取1 mL血液与抗凝剂缓冲液(柠檬酸钠1.32%，柠檬酸0.48%和葡萄糖1.47%)混合, 随后移置到1.5 mL 无RNA酶的离心管中, 在4℃下4000 r/min离心10min，随后将上清液丢弃将血细胞保存下来, 样品标记编号后统一放置于液氮中保存。
1.3 三疣梭子蟹Pt-ddit4l基因cDNA全长的克隆
根据本实验室全基因组重测序数据库中得到的Pt-ddit4l基因部分序列, 使用引物设计软件Primer Premier 6.0 设计中间片段扩增引物, 以及5′和3′所需要的基因特异性引物, 引物参见表 1, 由北京睿博兴科生物科技有限公司进行合成。
利用引物REDD2F/ REDD2R进行基因中间片段扩增, PCR反应扩增体系为20 μL, 包括: 13.6 μL ddH2O, 2.5 μL 10× Trans Taq® HiFi Buffer I, 1.6 μL 2.5 mol/L dNTPs, 0.4 μL Trans Taq® HiFi DNA Poly-merase, 0.4 μL Forward/Reverse primer (10 μmol/L) and 1 μL template DNA。反应程序如下所示: 94℃, 5min; 94℃30s, 60℃30s, 72℃, 1min, 35个循环; 72℃, 10min; 4℃, 恒温保存。将扩增得到的PCR产物送交青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，然后和获得的unigene片段进行比对, 确保保守区域的正确性。
使用SMART TM RACE试剂盒对Pt-ddit4l基因3′和5′进行扩增, 先进行第一轮PCR扩增, 使用引物REDD
2F1/REDD2R1和UPM进行扩增; 随后将PCR产物稀释10倍作为下一轮扩增的模板, 使用引物REDD2F2/REDD2R2和NUP混合进行第二轮PCR扩增, 反应体系和程序如上所述。制备1%的琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳, 将正确的电泳条带经DNA切胶回收、pMD18-T载体连接、转化入DH5α感受态细胞中, 最后挑选单一菌落并使用通用引物M13F/M13R(表 1)进行阳性克隆鉴定, 筛选目的菌液完成测序。
1yys1.4 生物信息学分析
使用Vecror NTI 11.0软件去除多余的载体序列, 然后将序列正确拼接, 拼接好的目的片段使用国家生物技术信息中心NCBI-BLAST(blast. ncbi.i)进行比对分析。使用
表 1 实验所用引物名称及序列
Tab. 1 Primers used in this study
引物Primer引物序列Primer sequence (5′—3′)用途Purpose
REDD2F TGGTAATTCGGCACTACACTT ORF验证REDD2R GTCACTACAACCGCAAACACT ORF验证REDD2F1CAGCAGTGGTCACCCTCATTA3′RACE REDD2F2ACCGCCACTATTTCCAAAGC3′RACE REDD2R1GGGTCCGCTCTTTGATGCA5′RACE R
EDD2R2CTGAAAGCGGAACCACTCG5′RACE UPM CTAATACGACTCACTATAGGGC
RACE通用
引物卵黄磷蛋白
NUP AAGCAGTGGTAACAACGCAGA
GT
RACE通用
引物
M13F GTTGTAAAACGACGGCCAG DNA测序
M13R CAGGAAACAGCTATGAC DNA测序
Pt-REDD2qF GGAGACGGGTGCCTGGATGG qRT-PCR
Pt-REDD2qRGAGGAGGAGCGGCGGGAAG qRT-PCR
β-actin-F GCATCCACGAGACCACTTACA qRT-PCR
内参
β-actin-R CTCCTGCTTGCTGATCCACATC qRT-PCR
内参
dsREDD2F TAATACGACTCACTATAGGGAT
GGCACATTTAAAAGTTCTCACCC
合成dsRNA
dsREDD2R TAATACGACTCACTATAGGGAT
CAGAACTTGTGGGTCGTCGTAG
合成dsRNA
2 期阎德平等: 三疣梭子蟹Pt-ddit4l基因的克隆及表达分析335
Bioedit和Gene Tool进行开放阅读框(ORF)的预测，并对编码的氨基酸进行翻译。氨基酸序列通过Pfam数据库(/search)进行蛋白质功能结构域预测分析; 蛋白质分子质量、不稳定性指数、亲水系数、理论等电点和信号肽通过Ex-PASy-ProtParam tool(/prot-param/)预测。使用分子进化遗传型分析软件MEGA 6.0以Neighbor-Joining 法构建系统进化树, 对Pt-ddit4l基因的亲缘关系进行进一步的分析。
1.5 Pt-ddit4l基因在发育不同时期的表达分析
使用RNAiso Plus试剂根据说明书步骤分别提取三疣梭子蟹不同发育时期总RNA。从提取的三疣梭子蟹发育不同时期总RNA中选取高质量的样品通过Reverse Transcriptase M-MLV (RnaseH)试剂盒反转录合成cDNA, 合成的cDNA模板用于后续实时荧光定量PCR。利用Primer Premier 6.0软件设计用于Pt-ddit4l幼体发育不同时期表达分析的荧光定量引物Pt-REDD1qF/ Pt-REDD1qR, 内参基因使用β-actin F/β-actin R(表 1)。以三疣梭子蟹发育不同时期的cDNA为模板, 进行实时荧光定量RT-PCR扩增。反应总体系为10 μL, 包括5 μL 2×ChamQ Uni-versal SYBR qPCR Master Mix, 1 μL Template cDNA, 0.4 μL Primer F(10 μmol/L), 0.4 μL Primer R(10 μmol/L), ddH2O补足至10 μL。每个样品设置3个平行重复和内参对照, 反应程序设置如下: 95℃10min; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 总共35个循环。
1.6 Pt-ddit4l基因mRNA表达分析
按照上述1.5的方法分别提取三疣梭子蟹9个组织和病原胁迫后各时间点样品的总RNA, 反转录合成cDNA。以稀释后的cDNA为模板, 进行实时荧光定量PCR。扩增体系和反应程序同上述发育不同时期。实时荧光定量PCR实验结果数据采用相对标准曲线法2−ΔΔCt法进行相对表达定量计算, 计算出平均表达量和标准差, 使用SPSS 19.0软件对计算结果进行单因素方差分析, P<0.05表示差异显著, 并通过OriginPro 2018将统计的结果整理成柱状图。
1.7 RNA干扰实验
Pt-ddit4l基因的双链RNA(dsRNA)的合成方法参照Kim等[12]的体外转录的方法合成, 设计的引物序列见表 1。将暂养1周后健康的三疣梭子蟹随机分为PBS阴性对照组和RNAi取样组, 每组各40只。按照Bai等[13]的实验方法进行注射, 对照组和实验组分别在梭子蟹游泳足第一关节基膜处注射50 μL 的dsRNA(1 μg/g)和PBS(10 mm/L), 在注射后的12h后每组随机取3只梭子蟹收集血细胞和肝胰腺，提取RNA, 利用qPCR检测dsRNA注射后REDD基因沉默的效率。并在注射后的第12h, 对照组和实验组再注射50 μL副溶血弧菌(浓度为3.8×106 cfu/mL)，在弧菌感染后的3h、6h、12h和24h统计每组梭子蟹的死亡率。该实验同时设置3个平行。
2 结果
2.1 Pt-ddit4l基因序列分析
Pt-ddit4l 基因cDNA全长2727 bp, 包括698 bp 的5′-UTR, 1522 bp的3′-UTR和507 bp的开放阅读框(ORF), ORF编码168个氨基酸(图 1), 预测分子质量为19.14 kD, 理论等电点为5.41, 不稳定系数为54.05, 亲水系数为−0.177, 归类为不稳定亲水蛋白。通过预测还发现该基因在13—15氨基酸处有一个糖基化位点, 在46—160氨基酸位置处含有一个RTP801_C结构域, 且该结构域在物种间相当保守。
利用MEGA 6.0软件对Pt-ddit4l编码的氨基酸序列与其他同源物种的氨基酸序列构建进化树分析, 结果如图 1所示, 本研究中的Pt-ddit4l先与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)聚为一支, 再与大型蚤(Daphnia magna)相聚, 它们的亲缘关系最近, 形成一个独立的分支, 接着与棘皮动物的紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus)、日本刺参(Apo-stichopus japonicas)和马蹄蟹(Limulus polyphemus)聚为一支, 而与同属梭子蟹科的滨蟹(Green Shore Crab)相距较远。
图 1 构建的DDIT4L的系统进化树
Fig. 1 The phylogenetic tree based on the sequences of different DDIT4L family members
进化树中所用蛋白的氨基酸序列的GenBank登录号: 凡纳滨对虾, XP_027223544.1; 大型蚤,JAL45518.1; 紫海胆, XP_ 787042.1; 日本刺参, PIK42874.1; 马蹄蟹, XP_022254613.1; 人, NP_660287.1; 小鼠, NM_029083.2; 斑马鱼, NM_200107.1; 滨蟹, DN550748.1
The GenBank accession numbers of protein sequences used for phylogenetic analysis are as follows: Litopenaeus vannamei, XP_027223544.1; Daphnia magna, JAL45518.1; Strongylocent-rotus purpuratus, XP_787042.1; Apostichopus japonicas, PIK 42874.1; Limulus polyphemus, XP_022254613.1; Homo sapiens, NP_660287.1; Mus musculus, NM_029083.2; Danio rerio, NM_200107.1; Green shore crab, DN550748.1
336水生生物学报45 卷
育时期, Pt-ddit4l 的表达量出现明显下调, 随后出现回升, 在溞状幼体Ⅳ期和囊胚期相比无显著差异(P >0.05); 随后大眼期的表达量也明显下调, 显著低于囊胚期(P <0.05)。
2.4 Pt-ddit4l 在副溶血弧菌感染后的表达分析
ddit4l 如图 4所示, 在血细胞中, 注射副溶血弧菌后, Pt-ddit4l 基因的表达量呈先上升后下降的趋势, 12h 时达到峰值, 是对照组表达量的8.85倍(P <0.05), 除24h 出现下调之外, 整体呈上调趋势。而在肝胰腺中, 注射副溶血弧菌感染后, Pt-ddit4l 表达量出现显著下调, 72h 达到最低值, 仅为对照组表达量的1/40 (P <0.05)。
2.5 注射dsRNA 后Pt-ddit4l 基因的表达分析及弧菌感染下死亡率统计
如图 5所示, 在肝胰腺中, RNA 干扰组6—24h
图 2 三疣梭子蟹ddit 4l 基因在健康组织中mRNA 相对表达量Fig. 2 The relative ddit4l mRNA level in healthy tissues of ddit 4l P. trituberculatus
B. 血细胞; S. 胃; BR. 脑; I. 肠; H. 心脏; E. 眼柄; G. 鳃; Hp. 肝胰腺. 图中“a, b, c, d”为SPSS 软件中Duncun 算法计算出的子集分组, 相同字母的表示差异不显著(P >0.05), 不同字母的表示差异显著(P <0.05)
B. hemocytes; S. stomach; BR. brain; I. intestine; H. heart; E.eyestalk; G. gill; Hp. hepatopancreas. The letters “a, b, c, d” are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicate that there is no significant difference in groups (P >0.05); the different letters indicate that there was significant difference in groups (P <0.05)
图 3 三疣梭子蟹不同发育阶段ddit4l 基因的相对表达量Fig. 3 Relative expression of ddit4l at different larval develop-ment stages of larval P. trituberculatus
nang. 囊胚期; yuan. 原肠期; yan. 眼点期; xin. 心跳期; Z1. 溞状幼体Ⅰ期; Z2. 溞状幼体Ⅱ期; Z3. 溞状幼体Ⅲ期; Z4. 溞状幼体Ⅳ期; M. 大眼幼体.图中“a, b, c, d”为SPSS 软件中Duncun 算法计算出的子集分组, 相同字母的表示差异不显著(P >0.05), 不同字母的表示差异显著 (P <0.05); 下同
nang. Blastocysts; yuan. Gastrula stage; yan. Eye period; xin.Heartbeat period; Z1. Daphnia Ⅰ stage; Z2. Daphnia Ⅱ stage; Z3.Daphnia Ⅲ stage; Z4. Daphnia Ⅳ stage; M. Megalopa. The letters “a, b, c, d” are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicated that there was no significant difference in groups (P >0.05), the different letters indicated that there was significant difference in groups (P <0.05). The same applies below
图 4 三疣梭子蟹血细胞和肝胰腺感染副溶血弧菌后Pt-ddit4l 的表达情况
Fig. 4 The relative expression of Pt-ddit4l in hemocytes and hepatopancreas of P. trituberculatus infected with V. parahaemolyticus
的基因表达量显著下调, 与对照组相比分别下降了17%、88.8%和36%; 在血细胞中, RNA 干扰组6—24
h 的基因表达量显著下调, 与对照组相比分别下降了61.7%、49.4%和81.1%。注射RNAi 后12h 再注射副溶血弧菌感染的死亡统计结果如图 6所示, 发现注射RNA 干扰的实验组相比起对照组死亡率明显增高, 这些结果表明Pt-ddit4l 参与了三疣梭子蟹弧菌感染后的免疫防御机制。
状幼体期间表达量与囊胚期相比没有显著上调(P >0.05), 推测Pt-ddit4l 基因可能主要在三疣梭子蟹的胚胎期发挥作用, 这与对小鼠胚胎染发现发育
早期的信号较强的结果相似[16]
。这些结果都表明Pt-ddit4l 基因可能发挥了一定的维持正常发育或抵御外界病原感染的功能。
3.3 Pt-ditt4l 基因的免疫防御机制
受到弧菌感染后, Pt-ddit4l 在肝胰腺中的表达量出现明显下调, 且显著低于对照组(P <0.05)。而
Imen 等[15]
通过对人单核细胞U-937进行瞬时转染的研究结果也表明在ddit4l 基因表达水平高的细胞中,Bax /Bcl 2 mRNA 的比率显著增加, 与正常细胞相比Bax 的表达量几乎不变或略微下降, 而Bcl 2基因的表达量却显著下降, 推测其可能介导了细胞凋亡，且在一定程度上抑制了凋亡基因发挥作用; 在受到弧菌感染后, 肝胰腺中Pt-ddit4l 表达量降低可能促进凋亡基因表达以清除体内病原微生物, 但其具体
机制尚不明确, 有待进一步的深入研究[17]
。甲壳动物免疫属于非特异性免疫, 血细胞在机体的抗病免
疫反应中发挥着重要的作用[18, 19]
疑罪从无
。
外界异物可以刺激血细胞提高其吞噬能力, 如对克氏原螯虾和扇贝注射病毒和细菌可显著提高它们血细胞的吞噬
活性[20—22]
。梭子蟹在受到副溶血弧菌入侵时, 血细胞可能产生吞噬作用将其转移到细胞内部后灭杀，而本实验结果也显示, 弧菌胁迫后Pt-ddit4l 的表达量显著上调, 12h 时在血细胞中达到峰值(8.85倍),
图 5 RNA 干扰后Pt-ddit4l 在三疣梭子蟹血细胞和肝胰腺中的表达情况
中软冠
Fig. 5 The relative expression of Pt-ddit4l in hemocytes and hepatopancreas of P. trituberculatus injected with RNAi
图 6 RNA 干扰下感染副溶血弧菌的梭子蟹死亡率统计Fig. 6 Mortality of swimming crab infected with V. parahaemoly -ticus by RNA interference
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