中国兽医科学 2021,51(03):395-402
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-12-16
D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0034 中图分类号：S852.43 文献标志码：A文章编号：1673_4696(2021)03-0395-08
樊一明\刘鑫楠2，魏治静2，包永占\董维亚3，张小兵2，吴萌2*
(1.河北农业大学动物医学院（中兽医学院），河北保定071000;2.河北省科学院生物研究所，
河北石家庄050081;3.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄050000)
摘要：为了表达牛乳腺相关血清淀粉样蛋白A3(M-SAA3)基因，获得其重组蛋白及单克隆抗体（MAb)，本研究将编码M-SAA3的基因片段经密码子优化后接入栽体pET-30a(+)中，然后转入大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞中进行表达。以镍柱纯化蛋白后，免疫BALB/c小鼠制备M-SAA3 MAb。结果显 示，扩增的M-SAA3 基因序列无误；M-SAA3基因成功转入表达栽体；菌液的诱导表达D™值=0.8为最优条件；重组蛋白纯度可 达98%，浓度为1.146 mg/mL；制得7株MAb效价均>1 : 1 600，亚型均为丨gG3，研制的3B2B4 MAb可分别 与M-SAA3的重组及天然蛋白特异性结合。该成果为将来针对M-SAA3的奶牛乳腺炎检测产品研发提供了 重要原料。 关键词：牛血清淀粉样蛋白A3(M-SAA3)；乳腺炎；原核表达；单克隆抗体（MAb)
Preparation of monoclonal antibody against bovine mastitis biomarker
serum amyloid A3 expressed li
FAN Yi-ming',LIU Xin-nan2,WEI Zhi-jing2,BAO Yong-zhan1,DONG Wei-ya3,
ZHANG Xiao-bing2,WU Meng2*
.C ollege o f V eterinary M edicine (Traditional C hinese V eterinary M e d ic in e)，H eb ei A g ricu ltu ra l U n iv ersity，B a o d in g 071000 .C h in a；2. Biology Institute ,H e b ei A c a d e m y o f S c ien ces y S h ijia zh u a n g050081, C hina ；3.H eb e i A n im al E p id em ic
Prevention a nd Control C enter .S h ijia zh u a n g050000 ,C/iiV irt)
泥土的微笑
Abstract：The aim of this study was to obtain recombinant bovine mammary-associated serum amyloid protein A3(M~SAA3) and its monoclonal antibody(MAb). After codon bias optimization for E. coii,the synthesized gene fragment encoding M-SAA3 was cloned into the expression vector pET-30a( +).Then it was transformed li BL21(DE3) competent cells for protein expression. The protein was purified by nickel chromatography,and the monoclonal antibody was prepared by immunizing BALB/c mice with the obtained recombinant protein. The sequencing showed that M-SAA3 gene was successfully cloned into the expression vector. The optimal induced expression condition of bacterial liquid was a A b o of 0•8.Purity of the prepared protein was up to 98%,and the concentration was 1. 146 mg/mL. The titer of all 7 strains of MAb were>1： 1 600, and the subtype were all IgG3. Among them,the 3B2B4 MAb could specifically bind to M-SAA3 recombinant and natural protein,respectively. This study provided important raw materials for the future research on the mastitis immunoassay of bovine M-SAA3.
收稿日期：2020-l 1-09；修回日期：2020-12-10
基金项目：河北省重点研发计划项目“两种急性期蛋白用于奶牛乳房炎诊断的免疫快速检测技术研究”（19222814D)；河北 省科学院科技计划项目“奶牛隐性乳腺炎诊断标志物抗体研制及定量检测技术研究”（19302)作者简介：樊一明（1993-)，女，河北石家庄人，硕士生，主要从事动物疫病的检测，
小学生创新作文
E-mail: *****************。*通讯作 者：吴萌（1975-)，男，副研究员，硕士，研究方向为细胞免疫学，Tel:*************，E-mail:****************。
396中国兽医科学第51卷
Key words：bovine mammary-associated serum amyloid protein A3 (M^SAA3)；mastitis；prokaryotic expression；monoc 1onal antibody(MAb)
* Corresponding author：WU Meng,E-mail ：biobang@sina. com
奶牛乳腺炎的发生会直接降低牛奶的产量和
牛乳的质量，对乳制品行业具有重要的经济影响，若不及时发现并予以将导致巨大的经济损失。血清淀粉样蛋白A(SAA)是主要的急性期蛋白之
一，因其具有抗菌和诱导炎性细胞因子的特性，能
及时反应机体的炎性状态，已经作为炎症的生物标
志物被广泛应用于感染相关的辅助诊断t'SA A家
族共有4种基因亚型（SAA1〜SAA4)。据报道，SAA
的4种基因亚型中，SAA1和SAA2编码急性期SAA(A-SAA)，是主要的炎症标志蛋白[：M]，SAA3是
奶牛在哺乳期和急性反应期由乳腺上皮细胞表达
和分泌的主要且唯一的SA A亚型，被命名为乳腺相
关血清淀粉样蛋白A3(M-SAA3)[6]。当细菌感染引
发奶牛乳腺炎时，M-SAA3的表达将上调，从而引发
急性期反应。有报道表明，奶牛乳腺系统中M-SAA3
的含量与乳腺炎的严重程度呈正相关[M3]。尽管
A-SA A血清中的浓度常作为诊断乳房感染的指标，更好地理解M-SAA3生理特点可改进奶牛乳腺炎
的早期检测与，降低经济损失[1«6]。
本课题组将M-SAA3基因进行密码子优化后，将其克隆人原核表达载体pET-30a(+)中，进行原
核表达、蛋白纯化及其单克隆抗体(MAb)的制备，并
分别对制备的蛋白及抗体进行了部分性能鉴定，以
期为日后奶牛乳腺炎的早期诊断技术研究奠定坚
实的基础。
1材料与方法
1.1细胞、质粒及实验动物
原核表达载体pET-30a(+)及SP2/0骨髓瘤细
表1扩增M-S A A3编码序列的引物
Table 1Primers for amplifying the coding sequence of M-S A A3胞均由河北省科学院生物研究所细胞生化研究室 保存。6〜8周龄的BALB/c雌鼠购自河北省实验动 物中心。
1.2主要试剂
StarPrep Plasmid Miniprep Kit和StarPrep Gel Extraction K it均购自北京康润诚业生物科技有限公 司。限制性内切酶Nde I和Xho I均购自New England Biolabs公司。Proteinlso Ni-NTA Resin、大肠杆 菌TranslO和BL21 star(DE3)感受态细胞均购自北 京全式金生物技术有限公司。Genshare超敏化学发 光底物检测试剂盒购自西安晶彩生物科技有限公 司。In-Fusion Cloning Kit 和 Bradford Protein Assay K it均购自宝生物工程（大连）有限公司。B C A蛋白 定量试剂盒购自Solarbio公司。弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂（FIA)、H T和H AT冻干粉 剂、PEG4000、吐温一20及鼠源单克隆抗体亚型试剂 盒均购自Sigma公司。胎牛血清和DMEM培养液均 购自Gibco公司。HRP标记山羊抗小鼠IgG购自北京 中杉金桥生物技术有限公司。HEPES购自Amresco 公司。
1.3 M-SAA3基因的优化与合成
以GenBank中登录的牛SAA3基因序歹ij(登录 号:AF540564.1)为原始序列，并根据大肠杆菌系统 进行优化。利用Primer premier软件设计扩增M-SAA3编码基因的弓丨物，弓丨物序列如表1所示。其 中，P1为上游引物，P2为下游引物，在引物上、下游 5'端分别加人BamH I和Xho I酶切位点（下划线部 分）。基因和引物均由北京六合华大基因科技有限 公司合成，预计扩增基因片段的大小为426 bp。
Primers 序列（5’—3’）Sequences
PI TAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTTCCTGATCCTGGGTGTTTC
P2 GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGTATTTGTCCGGCAGATAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTTCCTGATCCTGGGTGTTTC
1.4质粒构建及原核表达
将合成的M-SAA3基因序列从质粒中采用双 酶切将其切出，利用一步克隆法进行M-SAA3基因 扩增。反应体系：M-SAA3基因片段3m L，上、下游 引物各 1ML，2XGlexBuffer25 n L，Glexpolymerose 1M U无菌水补充至50 M U扩増程序：94 °C 5min;
94 °C 45 s，60°C 35 s,72 °C 90 s，共 34 个循环；72 °C 8 min；冷却至10 °C保存。将PC R产物经琼脂糖凝 胶电泳鉴定后，用胶回收试剂盒对M-SAA3基因目 的片段进行纯化回收。
第3期樊一明等：牛乳腺炎标志物血清淀粉样蛋白A3的原核表达及其单克隆抗体的制备397
将扩增后的目的基因与表达载体pET_30a(+)经限制性内切酶X/io I和iV cie I酶切后进行连接，并转化大肠杆菌TranslO感受态细胞进行载体扩 增。提取质粒进行序列鉴定，确保重组基因序列的 正确连接。
将正确连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，并将该细胞接种于L B液体培 养基。37 °C 200 r/min摇床培养1h后，涂板到200 m L含200 m L卡那霉素的L B固体培养基，37 °C培 养过
温室气体排放夜。挑取菌落转接于含卡那霉素的L B液体培 养基，37 °C 200 r/min摇床培养4 h。经P C R验证 后，筛选阳性菌液接种于L B液体培养基扩大培养，培养至分别为0.4、0.6、0.8、0.9时，加人终浓度 为0.1 mm ol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)进行 诱导表达。20°C培养18 h后离心，分别收取菌液沉 淀及上清。将沉淀物用复悬液重悬后，对其进行冰 浴超声破碎，并使用SDS-PA G E鉴定蛋白的表达情 况。
1.5重组蛋白的纯化及鉴定
将上述破碎后的菌液上清用0.45 滤膜进 行过滤后，使用Ni_NTA Resin亲和层析柱纯化His 标签蛋白。使用20 mmol/L咪唑缓冲液洗去杂蛋 白，收集100 mmol/L咪唑缓冲液的洗脱峰。纯化后 的蛋白分别用2 mol/L、4 mol/L、6 mol/L尿素的硼 酸缓冲液分步透析，并加入复性添加剂精氨酸和 GSH/GSSG。最后置于1X P B S中透析，彻底去除残 留的咪唑和尿素。超滤浓缩之后经SDS-PA G E电泳 鉴定蛋白纯度，并按照Bradford法蛋白质定量检测 试剂盒说明书测定纯化后的重组M-SAA3蛋白浓 度。
1.6单克隆抗体的制备及性能鉴定
1.6.1单克隆抗体的制备选择3只6〜8周龄雌 性BALB/c小鼠，将纯化后的M-SAA3重组蛋白与 弗氏佐剂均匀乳化作为免疫原，在背部皮下多点注 射免疫小鼠，免疫剂量为每只50 Mg。之后每隔14 d 重复免疫一次，其中弗氏完全佐剂用于第1次免 疫，弗氏不完全佐剂用于第2〜4次免疫。第4次免 疫7d后，
使用EL1S A方法检测血清中抗体效价，选 取效价较高的小鼠在细胞融合3天前，对小鼠进行 腹腔注射免疫原加强免疫。按常规方法用PEG进行 融合细胞的制备，获得的融合细胞用H AT培养基 悬浮，轻轻混匀后分装到含有饲养细胞的96孔细 胞培养板，在37 °C 5%C02培养箱中培养。培养7 d 后观察融合细胞的生长状况，并更换培养基为HT。观察孔板中不同细胞的生长状态，待生长到一定程度后，采用间接EL1S A进行阳性克隆的筛选。将检 测结果为阳性的细胞孔通过有限稀释法持续进行亚克隆，并使用间接ELISA方法监测孔板中细胞的 生长和抗体的产生，直至筛选出能稳定分泌单克隆 抗体的杂交瘤细胞株，将其扩大培养。通过在小鼠 腹腔内注射杂交瘤细胞株制备腹水，使用Protein A 柱纯化腹水制得抗体。
1.6.2 抗体效价分析以M-SAA3重组蛋白作为 检测抗原，以空转化的大肠杆菌BL21裂解蛋白作 为阴性对照，使用间接ELISA进行小鼠血清抗体效 价和细胞株分泌抗体效价检测。将抗原用碳酸盐缓 冲液稀释后，分装于96孔板中，包被浓度为2 yg/mL，每孔100 M U37 °C温育1〜2 h或4 °C过夜。使用 5%胎牛血清封闭后，使用PB ST洗涤3次，弃去残 余液体，然后加人倍比稀释血清或细胞培养上清，37°C孵育45 min。使用PBST洗涤3次后，加入稀释 比例为1 : 10 000的H RP标记小鼠IgG抗体，37°C 孵育30 min。使用PBST洗涤后，每孔加人100 m L T M B显液，37 °C避光孵育10 min，再加人硫酸终 止液，并使用酶联免疫检测仪读取D45〇值。
1.6.3 抗体亚型鉴定采用鼠源单克隆抗体亚型 试剂盒对制备的单克隆抗体进行亚型鉴定。按照试 剂盒
说明书，使用1 : 1 000稀释的亚型特异性结合 抗体包被酶标板，进行封闭处理后，每孔分别加人 阳性杂交瘤细胞株分泌上清，37 °C温育1h。弃去残 余液体并洗涤3次后，分别加人H RP标记的山羊抗 小鼠IgG，室温反应30 min。重复洗涤后，各孔加人 试剂盒配备的显液，37 °C温育10 min后，再加人 相应终止液，使用酶联免疫检测仪读取D,5〇值。
1.7 Western-blotting验证
1.7.1 检测单克隆抗体与纯化M-SAA3重组蛋白 的反应性制备12%分离胶、间隙胶和浓缩胶。将 纯化的M-SAA3重组蛋白与4 X Loading Buffer上 样缓冲液以3 : 1的比例混合，煮沸5 min。每孔上样 30 y L进行SDS-PA G E电泳，以空表达载体转化的 大肠杆菌BL21裂解液作为阴性对照。将蛋白胶转 印到N C膜，用5%的脱脂奶粉37 °C封闭1h。IX
T BST缓冲液洗涤3次，分别加入纯化的单克隆抗体，37 °C摇动孵育1.5 h。之后加人HRP标记的山羊抗 小鼠丨gG，37 °C摇动孵育1.5 h。洗涤后加人Gen- share 发光试剂盒显液显，用化学发光凝胶成像 仪拍照记录检测结果。
1.7.2 检测单克隆抗体与天然M-SAA3的反应性 选取经本课题组自制的牛血清淀粉样蛋白A检测 试剂盒测得牛S A A含量分别为0.35 ng/m L及25
398中国兽医科学第51卷
M g/m L的两例牛奶，分别作为天然M-SAA3的低值 及高值样本。使用B C A蛋白定量试剂盒检测该奶 样的总蛋白浓度，以P B S作为样本稀释液，每孔取 40 Mg蛋白上样，其余操作均与1.7.1相同。
2结果
2.1质粒构建及原核表达
2.1.1 P C R鉴定 P C R扩增出的M-SAA3基因片 段，经琼脂糖凝胶电泳，在426 b p处出现一条扩增 条带（图1)，与预期符合。
M12
2 000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
图1M-S A A3基因的PCR扩增
Figure 1Amplification of DNA for M—SAA3
M:D N A分子质量标准；1:M-S A A3基因；2：空白对照。
M：T r a n s2K D N A M a r k e r；1：G e n e of M-S A A3；2 ：Negative control.
2.1.2重组表达质粒鉴定重组表达质粒经；fto I 和Ncfe I限制性内切酶双酶切后，在琼脂糖凝胶电泳 中出现了 426 b p的目的条带及表达载体pET-30a (+)条带(图2)，测序正确后将重组质粒命名为PET- 30a(+)-M-SAA3。
2.1.3诱导表达条件优化使用经P C R筛选结果 为阳性表达的菌株，分别在菌液D™值为0.4、0.6、0.8、0.9时，在相同条件下进行重组蛋白的诱导表达，并 使用SDS-PA G E对比诱导效果。结果D_值为0.8 时出现较深的条带，而其他几组目的条带较弱，表明 在该条件下诱导表达量最高。表达产物以包涵体形 式存在于大肠杆菌的沉淀中，分子质量大小约为15 ku，与预测相符（图3)，表明成功表达了 M_SAA3重 组蛋白。
2.2重组蛋白的纯化及鉴定
将制备的M-SAA3重组蛋白经Ni-NTA Resin 亲和层析柱进一步纯化后，进行SDS-PAGE。结果 显示，纯化后的M-SAA3蛋白条带较单一，分子质 量约为15 ku，纯度可达98%(图4)。米用Bradford 法进行蛋白浓度测定，其浓度为1.146 mg/mL，可用
M1 2 3 4
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
800 bp
500 hp
300 bp
图2重组质粒pET-30a (+) -M-S A A3的鉴定
Figure 2 Identification of pET-30a( + )-M-SAA3 recombinant plasmid
M:D N A分子质量标准；1：重组质粒I单酶切；2：重组质粒Xho I 单酶切；3：重组质粒/Vde I和X h o I双酶切；4：重组质粒。
M：D N A Marker ；1 ：Nde I single restriction endonucleased recombinant plasmid；2：X h o I single restriction endonucleased recombinant plasmid ；3 ：N d e I and Xho I double restriction endonucleased recombinant plasmid；4：Recombinant plasmid.
M
170 kll m~
70 ku L'n
55 ku ___
40 ku
35 ku
25 ku
12 3 45
丨一—r w m M V
-----------w m
明基笔记本电脑.m i i -rnM m丨聲丨
丨
_丨
丨
_|_
15 ku—15 ku
10 ku
图3 M-SAA3重组蛋白表达条件的优化
Figure 3 Induced expression condition optimization of M-SAA3 recombinant protein
M：蛋白质分子质量标准；U空栽体菌液诱导；2：菌液Deoo值时
的诱导表达;3：菌液0««值=0.6时的诱导表达；4：菌液0«)〇值=0.8时 的诱导表达；5：菌液〇6〇〇值=0.9时的诱导表达。
M：Protein Ma r k e r；1：Induced expression of strains with empty vector；2: Induced expression of strains，w h e n Deoo =0.4; 3: Induced expression of strains,w h e n 〇6〇〇=0.6；4 ：Induced expression of strains,when 〇6〇〇= 0.8 ；5 ：Induced expression of strains,w h e n Dm=0.9.
于后续动物免疫。
2.3 M-SAA3单克隆抗体的性能鉴定
2.3.1 效价鉴定采用间接ELISA方法对小鼠血 清和稳定分泌M-SAA3单克隆抗体的细胞株进行 抗体效
价测定。结果1〜3号小鼠的效价分别为 1 :51 200、1 :12 800、1 : 1 600，表明小鼠产生的多克 隆抗体均可与研制的M-SAA3重组蛋白发生免疫
第3期樊一明等：牛乳腺炎标志物血清淀粉样蛋白A3的原核表达及其单克隆抗体的制备399
100 ku
70 ku
55 ku
40 ku
35 ku
25 ku1
2 3 4
15 ku
> 15 ku
血粘
10 ku
图4 M-SAA3重组蛋白的纯化
Figure 4 Characterization of M-SAA3 recombinate protein M：蛋白质分子质量标准；1：菌体沉淀破碎液；2：穿透液；3:20 m m o l/L 咪唑洗脱杂蛋白；4:100 m m o丨/L咪唑洗脱蛋白。
M：Protein molecular weight M a r k e r；1：Ultrasonic fragmentation of bacterial precipitation ；2 ：Penetrating fluid ；3 ：Other proteins washed out by 20 m m o l/L imidazole；4：Protein washed out by 100 m m o l/L imidazole.
反应。其中，l号小鼠血清抗体效价最高，因而选用 1号小鼠的脾细胞进行细胞融合。以M-SAA3重组 蛋白作为包被抗原，以空表达载体转化的大肠杆菌 BL21 Star(DE3)裂解液为阴性对照，经多轮间接EL1SA 阳性孔检测和有限稀释法克隆，获得了 7株稳定分泌 抗M-SAA3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为 1D5E5、1G7A9、1F12C5、2F7C8、3B2B4、4B9D10、4E9F3。间接ELISA法对7株细胞分泌抗体进行效 价测定，结果显示，效价均大于1 : 1 600(图5A)。用 Protein A柱对这7株单克隆抗体进行纯化，纯度可 达95%以上（图5B)。
2.3.2亚型鉴定采用鼠源单克隆抗体亚型检测试剂盒鉴定制得抗体的亚型。经鉴定，这7株单克 隆抗体的亚型均属于IgG3亚类（图6)。
2.4 Western-blotting验证
2.4.1 检测单克隆抗体与纯化M-SAA3重组蛋白 的反应性以M-SAA3重组蛋白作为抗原，空表达 载体转化的大肠杆菌BL21裂解液作为阴性对照，使用Western-blotting检测制备的7株单克隆抗体 与纯化后的M-SAA3重组蛋白的反应性。结果显示 (图7),M-SAA3重组蛋白与3B2B4单克隆抗体可 发生特异性结合反应，与大肠杆菌裂解液不发生免 疫反应，且其条带与预期片段大小相符，约为15 ku。
2.4.2 检测单克隆抗体与天然M-SAA3的反应性 研制的7株单克隆抗体与M-SAA3高值样本用Western-blotting检测，3B2B4 细胞株在约 15 ku 的位置出现一条较深的条带，而与低值样本出现一条c! 2.
、、、V\\<、、\
倍比稀释Serial dilution
1 2 3 4 5 6 7
M
55 k u■ ..
40 k u■
35 k u^
25 k u—
10 k u
图5单克隆抗体的效价及纯度鉴定
Figure 5 Determination of titer and purity identification of monoclonal antibodies
A：单克隆抗体的效价测定；B：单克隆抗体纯度鉴定。M：蛋白质分子 质量标准；1:1D5E5;2:1G7A9;3:1F12C5;4:2F7C8;5:3B2B4;6: 4B9D10；7：4E9F3〇
A：Titer evaluation of the manufactured monoclonal antibodies ；B：P urification of the manufectured monoclonal antibodies.M：Protein molecular weight Marker ；1：1D5E5；2 ：1G7A9；3 ：1F12C5；4 ：2F7C8；5 ：3B2B4；6 ：4B9D10；7：4E9F3.
2.0
1.5
cf 1.0
亚型 Isotyping
图6单克隆抗体的亚型鉴定
Figure 6 Isotype identification of monoclonal antibodies
閉1D5E5
m1G7A9
圓1F12C5
國2F7C8
S3B2B4
防范风险r a4B9D10
E34E9F3
M m〇llllein illean i ilsnan l l l s f：
IgGl IgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM
较浅的条带（图8)。表明该抗体可特异性的识别天 然M-SAA3蛋白。
3讨论
目前，由于奶牛乳腺炎具有较高的发病率，致病 因素较复杂，且发病后部分奶牛临床症状不明显，现 有预防措施及检测技术不能较好地防控病情，
导致
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