担当者
套式引物（Nested Primer）PCR 用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。 耐万古霉素肠球菌>海洋幼虫
若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（至25～30bp），同进缩短内引物长度（15～17bp），使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次PCR，而灵敏度与套式二次PCR无异，在我们最近推出的PTC 51气流式DNA热循环仪上就可以完成全部程序。
套式一次PCR的成功，使PCR检测的全过程可以在5h内完成，使当天出检验报告成为现实，也使PCR检测走入临床有了现实的基础
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巢式PCR和普通PCR在反应原理上是相同的 不同之处在于 巢式PCR第二轮的模板不是全部CDNA 而是 第一轮反应后的产物（通常取第一轮反应的1/10作为第二轮反应的模板)
我做过巢式 放大作用非常明显 外引物扩增跑胶完全见不到条带的情况下 用内引物扩增可以见到明显的条带 但假阳性的可能性也大大提高 操作时要避免交叉污染
连承敏使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
巢式PCR
为增加敏感性和特异性使用巢式引物是PCR的另一种形式。巢式PCR的模式是由两轮PCR扩增反应组成，利用两套PCR引物对，分别为内引物和外引物。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此
产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增
。 这样经过两轮扩增，可以将痕量的模板DNA扩增到可以检测到的量。由于两对引物的参与，这样也
大大提高了扩增的特异性。
该方法比较简单，是在普通PCR的基础上，为了扩增痕量DNA模板而发展起来的技术。比如HCV痕量病毒的检测，早期都是采用此扩增方法。
fastdbDNAgirl ，我现在正在做5‘-RACE，也遇到了你所贴的电泳图中的情况，怎么办都解决不了！，你的情况是怎么解决的阿？
sbwan , 我后来降低了模板的浓度，稀释了成原来的50倍。退火的时间延长到一分钟。条带就特异了。但是我想还是跟最初的模板有关系，因为我是取的DNA经酶切后的连接产物。也很奇怪啊，现在我换了另外几个样品，又出现了原来的情况。极度不解中啊－－，我想应该是模板的问题。不管怎样，我们遇到磕磕碰碰都不能放弃啊，放弃就等于以前的努力都白费了。呵呵，之前将近两个月的重复几乎使我崩掉呢，后来taro还有其他战友的指导建议，我还是不停的重复，也有几个样品成功了。
祝你好运
DNAgirl ，谢谢你的建议与支持！降低模板浓度，延长退火时间我都试过了，可效果不佳，那还真可能是最初的模板的问题，我会再做一次翻转录的。我想我们所有的战友也都会相互支持着将试验进行到底！
去年年底我做3‘的时候也遇到了这个情况，现在我重新换了模板、翻转录酶结果3’很容易出来了。但5‘的产物无论如何就是弥散或者是什么也没有，但用5’－cDNA扩3‘的片段却是很容易就出来了，可能什么原因呢？望大家指点！
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