（11陕西中医药710016）
紫草素通过调控Hippo-YAP 信号通路对咪q 莫特 张凡4，王星星2，朱新景
1景慧玲
2
，王*江4
大学，陕西咸阳712000 ；2.陕西省西安市中医医院，陕西 西安［摘要］
探讨紫草素通过调控Hippo-YAP 信号通路对咪5莫特
诱导的银屑病模型小鼠的影响及作用机制。 将25只BALB/C 雄性小
鼠随机分为正常组、模型组、紫草素高浓度组、紫草素中浓度组、紫草素低浓度
组，每组5只。背部剃毛3 cm X5 cm，正常组每日定时在小鼠裸露处皮肤均匀 涂抹纯凡士林，模型组外涂5%咪5莫特乳膏，紫草素高、中、低浓度组均在外 涂5%咪5莫特乳膏的同时分别给予80 m//（ // - i ）、40 m//（ // - i ）、20 m//
（// • i ）紫草素混悬液灌胃，均1次/d，连续7 i 。观察并记录各组小鼠背部
皮损面积和严重程度指数（PAS ）评分，取小鼠背部皮肤组织进行HE 染病理观察；ELISA 法检测 正常组、模型组、紫草素高浓度组小鼠皮损组织中白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-22（IL - grf22）、肿瘤坏死因子-a （TNF - a ）水平,RT - PCR 法检测正常组、模型组、紫草素高浓度组小鼠皮
损组织中RASSF1A 、CXCL1、CXCL2、S140A7、YAP 、TAZ mRNA 表达水平。
模型组和紫草素
各组PASL 评分均明显高于正常组（P 均＜0.05），紫草素高、中、低浓度组均明显低于模型组（P 均＜
0.05），紫草素高浓度组明显低于中、低浓度组（P 均＜0.05）。模型组小鼠皮损组织中）L-17、）L-22、 TNF-a 水平和CXCL1、CXCL2、S140A7、YAP 、TAZ mRNA 表达水平均明 显高于正常组（P 均＜
0. 05） ,RASSF1A mRNA 表达水平均明显低于正常组（P ＜0.05）；紫草素高浓度组小鼠皮损组织中 IL-17、IL-22、TNF-a 水平和 CXCL1、CXCL2、S100A7、YAP 、TAZ mRNA 表达水平均明显低于模
型组（P 均＜0.05） ,RASSF1A mRNA 表达水平均明显高于模型组（P 均＜0. 05）。
紫草素通
过升高皮肤基底RASSF1A mRNA 的含量，降低Hippo - YAP 信号通路上游趋化因子YAP 、TAZ 的 含量，致下游趋化因子和炎症因子降低达到抗银屑病的作用。
［关键词］ 银屑病；紫草素；Hippx-YAP 信号通路；BALB/C 小鼠
dxt ：10.3969/j. issn. 1008 -8849.2021.06.002
［中图分类号］R332 ［文献标识码］A ［文章编号］1008 -8849（2021）06 -0578 -06
Strdy on the prrtective effect of shiVoniv on imiquimorivduced psoricsit moust model
by rreulativg the Hiqpo-YAP siqnalivg pathwcy
ZHANG Fan 1 , WANG 乂////2 , ZHU Xinjin/1 , JING Huilina 2, WANG Wanjiana 1
（1. Shaanpi University oS Tranitioxal Chinese Medicine , Xianycn/ 712000 , Shaanpi , China ； 2. Xi'an Hospital oS Tranji hoxal Chinese Medicine , Xi' an 710016 , Shaanpi , China ）
Abstract : Objective L is to investi/ate the effect ani mechanism oS shinoxin ox imipuimoU-ipiuced psoriasis moUel mice by reaulatin/ the Hippo-YAP si/na/n/ pathway. Methodo 25 BALB/C male mice were ranhomly iiviped into normal /roup , moUel /roup , shinoxin hi/h coxcedtrahox /roup , shinoxin medium coxcedtrahox /roup , ani shinoxin low coxcedtrai hox /roup , with 5 mice in each /roup. Shaved 3 cm x 5 cm on the bach. Pure petroleum jelly was evedly app/ed to the ex
posed shin oS the mice in the normal /roup at reaulas interwls everu iay , 5% imipuimoU cream was applied in the moUel ［作者简介］张凡，女，硕士，主要从事皮肤病的中医临床研究工作。［通信作者］ 景慧玲，E - mail ： 1741867369@ qq. 5om ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（8170408
独立空间）
/
roup,ani the mice in the hi/h,medium ani low coxcedtrahox/roups were/ivex80m//(//•i),40m//(//•i),20 m//(//•i)sPiPoxin spspexsiox by intraaastrio anministratiou based ox the moUel/roup,both1,couhnuously treated for77.The psoriasis area ani severity inhex(PASL oS bach shin oS the mice in each/roup were oiserved ani rc-corUed,the bach shin tissues oS the mice was tanex for patholopical oXservahox by HE stainin/；ELLA was used to ietcot the levels oS ipteUeuein-f4((L-f7),ihterlexPin-62((L-62)anh tumos necrosis factouc(TNF-c)in the shin lesions oS mice in the normal/roup,moUel/roup,ani shiPoxin hi/h coxcodtratiox/roup,RT-PCR methoi was used to ietcot the ex-pressiox levels oS RASSF1A,CXCL1,CXCL2,S100A7,YAP,TAZ mRNA in the shin lesions oS mice in the normal /roup,moUel/roup,ani shiPoxin hi/h coucodtratiou/roup.Resolto The PASL scores oS the moUel/roup ani shiPoxin /roups were si/nificantlc hi/hes than those oS the normal/roup(all P<0.05),ani the hi/h,medium,ani low1X1x00-hox/roups oS shiPoxin were si/nificantlc lower than that oS the moUel/roup(all P<0.05),ani the hi/h coucodtratiou /roup oS shiPoxin was si/nificantlc lower than the miPdlc ani low coucodtratiou/roup(P<0.05).The levels oS IL-f4,IL-22,TNF-p anh the expression levels oS CXCL1,CXCL2,S100A7,YAP,TAZ mRNA in the shin lesions oS the moUel /roup were si/nificantlc hi/hes than those oS the normal/roup(P<0.05),ani the expression level oS RASSF1A mRNA was si/nificantly lower than that in the normal/roup(P<0.05).The levels oS IL-f4,IL-62,TNF-p anh CXCL1,CX-CL2,S140A7,YAP,TAZ mRNA expression in the shin lesions oS mice
in the shiPonin hi/h coucodtratiou/roup were lower than those in the moUel/roup(all P<0.05),the expression levels oS RASSF1A mRNA was si/nificantlc hi/hes than that in the moUel/roup(all P<0.05).Conclusion ShiPonin coulU increase the coutedt oS RASSF1A mRNA in the shin ani reduce the coutedt oS YAP ani TAZ in the Hippo-YAP si/nalin/pathway,thus to iccrease chemoUines anh innammato-m factors to achieve anti-psoriatic effects.
Keyword::psoriasis；shiPonin；Hippo-YAP si/nal pathway；BALB/c mice
银屑病是一种常见的易于反复发作的慢性炎症性皮肤病，病程长，可累及皮肤、毛发、指趾甲等部位，临床表现多种多样，主要表现为瘙痒、鳞屑和红斑，可并发自身免疫病、代谢综合征、心血管疾病、肿瘤及心理、精神类疾病⑴。银屑病的尚未有明确的特效药，主要是使用免疫抑制剂、皮质类激素和维A酸类等，但是不能长期使用，且效果因人而异。中医认为银屑病是由于素体血中蕴热，复感风热毒邪，或恣食腥发动风之物，或情志内伤，五志化火，两阳相合，内不能疏泄，燔灼血液，充斥肌肤,“血分有热”是银屑病的主要发病原因，清热凉血法是银屑病的主要方法。紫草首载于《神农百草经》，具有清热解毒、凉血止血、透疹发斑作用[2]，是银屑病的常用药物之一，既可单味药使用，又可与其他药物配伍使用，既能内治又可外用，临床疗效肯定。紫草素是紫草的主要有效成分，现代药理研究认为紫草素具有抗炎、抗肿瘤、抗过敏的作用[3「5]，但其银屑病的作用机制尚不明确。本研究主要探讨紫草素通过调节皮肤基底的RAS含量干预Hippc-YAP信号通路达到
抗银屑病的作用。
1实验材料与方法
1.1实验动物25只SPF级BALB/C雄性小鼠,6-8周龄，体质量18~22/i由三峡大学提供，动物许可证号:SYXK(鄂)2017-0012。小鼠饲养于SPF 级动物实验中心，室温22T，整个实验期间允许动物自由采食、饮水，定期更换垫料，并给予12h光照/12h黑暗循环。
1.2试剂与仪器紫草素(Si/mn，货号：S7576)；5%咪唾莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司，国药准字H20030128)；凡士林(上海泽叶生物科技有限公司)；IL-17、IL-22、TNF-a ELISA试剂盒(伊莱瑞特)；苏木素(Si/mn，货号:H9627)；伊红Y(水溶性)(国药集团，货号：71014544)；Tuzcl(Ambt-ox)；HiScUp-Ravama Transcriptase(RNasc H) (VAZYME)；5x HiScUpt Buffer U VAZYME)；RiPoxuc cleasc InhinScs(TransGex)；iNTP(TIANGEN)；50x ROX Referexca Dya2(VAZYME)；SYBR Greex Mate ter Mix(VAZYME)；Taq Plus DNA Polymerase(TIAN-GEN)；DL2000DNA MarUas(TIANGEN)；Raniom PumamN6)(TAKARA)。病理切片机，切片刀，组织摊烤片机，显微镜，离心机，电热恒温培养箱，Flep Station3多功能酶标仪，电热恒温鼓风干燥箱，实时荧光定量PCR仪，荧光定量PCR管，PCR仪，紫外分析仪。
1.3分组、造模及干预取BALB/C雄性小鼠25只，随机分为正常组、模型组、紫草素高浓度组、紫草素
中浓度组、紫草素低浓度组，每组5只。小鼠(80m//k/)腹腔注射麻醉，背部剃毛面积约
3cmx5cm。正常组：每日定时在小鼠裸露处皮肤均匀涂抹纯凡士林，、次/d，连续7d；模型组：外涂5%咪唾莫特乳膏，、次々,42mg/次，连续7i；紫草素高浓度组：外涂5%咪唾莫特乳膏，1次々,42mg/次，同时给予80皿/兀麗•i）紫草素混悬液灌胃，连续7i；紫草素中浓度组：外涂5%咪唾莫特乳膏，1次/d,42mg/次，同时给予40mg/（kg•i）紫草素混悬液灌胃，连续7i；紫草素低浓度组：外涂5%咪唾莫特乳膏2次/i,42mg/次，同时给予2。m//k k/•d）紫草素，7i。
1- 4观察指标与方法
1.4.1体征观察用数码相机记录每组小鼠的皮损变化，采用PASI评分标准对各组小鼠相应红斑、鳞屑及浸润程度进行评分（0分=无，1分=轻度，2分=中度2分=重度,4分=极重度），最后将三者积分相加得到总积分，并依据银屑病皮损面积和疾病严重程度指数（PASI）评分，将各组小鼠积分取平均值后绘制皮损积分趋势线，观察各组小鼠皮损的变化情况。
1.4.2组织病理学观察各组小鼠干预结束后处死，取背部裸露皮肤，在生物组织脱水机中将皮损组织经乙醇脱水、透明剂透明和浸蜡，接着使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中，切片（厚度约4”m）、烤片、脱蜡、Mayer氏苏木素染液染和水溶性伊红染液染，风干后中性树胶封片，显微镜下观察。
1.4.3皮损组织中IL-17、IL-22、TNF-a表达水平检测取正常组、模型组、紫草素高浓度组小鼠皮损组织，用预冷的PBS冲洗，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与PBS按1：9的比例混合，加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。最后将匀浆液于5000r/min离心5~10min，取上清液，按照TNF-a、IL-1、IL-22的ELISA试剂盒说明。
1. 4.4皮损组织中RASSF1A、CXCL1、CXCL2、S100A7、YAP、TAZ mRNA表达水平检测取-80C 冰箱中保存的新鲜冰冻正常组、模型组、紫草素高浓度组小鼠皮损组织，使用T/zu I法提取总RNA。根据吸光光度值按下列公式计算样品RNA的浓度：总RNA浓度（ixg/ixL）=OD260x40x10-3O使用逆转录试剂盒生成cDNA后，稀释5倍在检测系统上进行逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），数据以2-aa"进行分析。基因特异性引物序列: RASSF1A上游5'-CCAGCAAGAAACCACCTTCC-3'，下游5'-CCGTTCAGTTCGCTCAAAGA-3'；CXCL1上游5-CACCTCAAGAACATCCAGAGC-3'，游5'-CTTGGGGACACCTTTTAGCA-3'；CXCL2上游5'-AGTGAACTGCGCTGTCAATG-3'，下游5'-CAGGGTCAAGGCAAACTTTTT-3'；S100A7上游5'-ACACTGCTTCCATCACTATGC-3'，下游5'-TTTTGTCAGCTGCCCGGAA-3'；YAP上游5'-ACCCTCGTTTTGCCATGAAC-3'，下游5'-TTCAACCGCAGTCTCTCCTT-3'；TAZ上游5'-CTGCGCTTCAAATGGGTAGGA-3'，下游5'-CAAAGCGGGGGAAGTAGGG-3'；GAPDH上游5'-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3'，下游5'-CAGG-GATGATGTTCTGGGC A-3'。
1.5统计学方法实验结果使用Graph Prime7,0软件进行统计分析，计量资料采用均数土标准差（土s）表示，符合正态分布和方差齐性的采用多样本单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
乳糖操纵子2结果
2.1各组小鼠皮损及PASI评分比较模型组小鼠造模第2天开始背部剃毛皮肤出现红斑、鳞屑和厚度增加，之后持续进展；紫草素各组小鼠造模第2天开始背部剃毛皮肤出现发红，附有鳞屑及肥厚的现象，但是与模型组相比程度明显减轻，且紫草素浓度越高，皮损越轻。PASI评分显示，模型组和紫草素各组均明显高于正常组（P均＜0.05），紫草素高、中、低浓度组均明显低于模型组（P均＜0.05），紫草素高浓度组明显低于中、低浓度组（P均＜0.05）。见图1及图2。
微电极测井2.2各组小鼠皮肤组织病理学表现HE染结果显示，正常组小鼠皮肤组织基底层为单层柱状细胞；模型组小鼠皮损表皮向下延伸，角化不全，颗粒层减少或消失，棘层增厚，炎性浸润；紫草素各组小鼠皮损表皮厚度减少，棘皮病减轻和轻微炎性细胞浸润，且皮损减轻程度与紫草素浓度成正向相关。见3。
2.3各组小鼠皮损组织中IL-17、IL-22、TNF-a 表达水平比较模型组、紫草素高浓度组小鼠皮损组织中IL-17、IL-22、TNF-a表达水平均明显高于正常组（P均＜0.05），紫草素高浓度组小鼠皮损组织中IL-17J L-22、TNF-a表达水平均明显低于模型组（P均＜0.05）。见图4。
2.4各组小鼠皮损组织中RASSF1A、CXCL1、CX-CL2、S100A7、YAP、TAZmRNA表达水平比较紫
紫草素高浓度组
张博树正常组模型组紫草素中浓度组紫草素低浓度组图1各组小鼠实验第7天皮损表现正常组模型组
紫草素低浓度组 紫草素中浓度组
束腰
紫草素高浓度组
+正常组*模型组
*紫草素低浓度组
紫草素中浓度组♦紫草素高浓度组
■•-正常组
模型组
紫草素低浓度组—紫草素中浓度组 +紫草素高浓度组
正常组模型组
紫草素低浓度组 紫草素中浓度组 ♦紫草素高浓度组
图2各组小鼠不同时间皮肤病变红斑评分、鳞屑评分、厚度评分及总评分
O 8
正常组紫草素高浓度组
模型!组紫草素中浓度组紫草素低浓度组图3各组小鼠皮肤组织病理学HE 染表现
草素组小鼠皮损组织中RASSF1A mRNA 表达水平 明显低于正常组（P < 0, 05） , CXCL1 CXCL01
S150A7、YAP 、TAZ mRNA 表达水平均明显高于正常
组（Pt <0.05）；紫草素对银屑病小鼠模型皮损组 织中趋化因 转录因子有明显干预作用。见图5。3讨 论
银屑病是一种免疫介导的炎症性皮肤病，发病
机制尚不清楚，主要是免疫细胞活化产生大量的趋
化因子和炎症细胞因子，介导嗜中性粒细胞的募集, 形成Muca 微脓肿⑷。银屑病皮肤炎症的发生，是
由于活化的RAS 基因在皮肤基底上的过表达引起 的[7-8] ,RAS 在基底角质形成细胞（KC ）中的过表达
导致银屑病皮肤发炎、棘皮增厚、角化过度，表皮内 中性粒细胞和T 细胞包括IL - 17、、LN - y 、CD8*T
图4各组小鼠皮损组织中IL-17、IL-22、TNF-a水平
图5各组小鼠皮损组织中RASSF1A、CXCL1、CXCL2、S10A7、YAP、TAZ mRNA表达水平
细胞浸润g10。过表达RAS的KC可能通过释放子（VEGF）诱导的血管生成的关键介质［6］。Hippc-
与CD8+T细胞上特异性表达的CXCR6相互作用的CXCL16介导CD8+T细胞进入人类皮肤［11］，优先在CD8+T细胞上表达，产生ILN-y和IL-17，有中性粒细胞Munro微脓肿形成［11-12］，增强KC活化和增殖［3］，促进中性粒细胞吸引CX-CL1和S100家族成员（S100A7,S100A8和S100A9）的KC产生“3-14，并有助于CD4+T细胞活化，有利
于CD4+T细胞渗入皮肤［8-9］，产生IL-17、IL-22、TNF-a4L-22［1•5•39］。IL-17参与免疫反应，
可促血管生成，表皮，中性粒细胞浸润与活化。IL-22可促角质形成细胞生成，诱导细胞免疫紊乱，加重银屑病。TNF-a主要由单核巨噬细胞产生，是一种促炎症性细胞因子，可诱导趋化因子和黏附因子，活化中性粒细胞与血管内皮细胞而引起机体强烈的炎症反应，在诱发银屑病的炎症增生过程及维持银屑病炎性浸润中起重要作用［5］。
Hippc-YAP途径是一个由一系列蛋白激酶和转录因成的激酶级联反应，是血管内皮生长因YAP/TAZ的失调，影响T细胞的增殖分化，导致自身免疫和/或炎症性疾病［7。成年基底表皮细胞核中YAP的表皮肤［18］,YAP TAZ缺失导致伤口愈合能力减弱［］。RASSF1A为RAS的效应蛋白，其可与YAP结合。银屑病细胞与鳞状细胞癌（Cscc）细胞极为相似,YAP可能通过激活与Cscc细胞相关的AREG/RAS/AKT/ERK 轴［1］，调节银屑病角质形成细胞的细胞增殖、细胞周。
既往研究证实，紫草素可通过JAK/STAT3途径的激活诱导CEBP-8蛋白表达下调，抑制角质形成细胞的增殖［20］；可通过抑制AKT/mTOR途径来有效iTrea细胞的分化的发展［21］；还可抑制血管增生，通过阻滞JAK4/STAT3途径抑制IL-17的VEGF表达［22］。本实验结果显示，紫草素能够改善咪唾莫特诱导的银屑病皮损，减少皮损厚度、红斑及鳞屑；且紫草素干预后，小鼠皮损中IL-17、、L-22,TNF-a水平和CXCL2、S140A7、YAP、
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