隐丹参酮单剂量和多剂量给药在大鼠体内药代动力学研究 曾金;王猛猛;沈淑娇;张志荣;蒋健;裘福荣
【摘 要】目的 评价单剂量和多剂量灌胃隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTS)的药动学特征.方法 将20只SD雄性大鼠随机分为单剂量组(隐丹参酮10 mg/kg,1d)、多剂量组(隐丹参酮10 mg/kg,每天1次,连续10 d)给予灌胃后,用LC-MS/MS法测定血浆中隐丹参酮的浓度.血药浓度数据用DAS 2.0药代动力学软件处理,按两室模型拟合并求算药代动力学参数.结果 隐丹参酮单剂量给药后,Cmax为(12.16±14.11)ng/mL,Tmax为(2.88±2.56)h,T1/2为(3.70±3.50)h,MRT为(6.69±0.54)h,AUC0-24为(58.40±25.73)ng·h/mL;多剂量给药后,Cav为(1.95±0.61)ng/mL,Tmax为(3.20±2.08)h,T1/2为(7.12±5.06)h,AUCss为(46.74±14.51)ng·h/mL,DF为2.42±0.28.单剂量和多剂量的AUC0-24、Tmax、T1/2差异无统计学意义.结论 隐丹参酮长期给药后无蓄积风险. 【期刊名称】《湖南中医药大学学报》
【年(卷),期】林产化学与工业2015(035)004
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】隐丹参酮;单剂量和多剂量;药代动力学;LC-MS/MS
【作 者】曾金;王猛猛;沈淑娇;张志荣;蒋健;裘福荣
【作者单位】上海中医药大学附属曙光医院临床药理科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院临床药理科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院临床药理科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院临床药理科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院临床药理科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院临床药理科,上海201203
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5;R969.1
财经月历目前临床上许多药物长期使用会产生蓄积或耐药现象，有特殊用途的药物如抗肿瘤药、抗病毒药等出现蓄积现象提高药物在体内的血药浓度，加大临床药物运用的危险性；耐药将会降低患者体内的药物浓度，使药物的作用降低甚至消失。纵观临床上发生耐药现象， 究其原因可能是长期服药后造成体内药物代谢酶发生变化，进而影响药物在体内的吸收、代谢、排泄等过程，加速药物排出体外；而蓄积效应的原因则更需要研究，以便更有效的保证临床用药的安全可靠。
隐丹参酮（Cryptotanshinone，CTS）是中药丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的脂溶性成分之一。丹参味苦，微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效。CTS是二萜醌类化合物，是从丹参中提取出的脂溶性混合物丹参酮成分之一，这类化合物在骨架上大多具有三元或四元碳环的邻醌或对醌结构，其特殊结构使其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等活性。在众多实验及临床研究中发现，CTS单体在抑制细菌生长[1]、改善组织炎症[2-3]、抑制肿瘤增殖[4]、改善脑缺血损伤[5]、多囊卵巢综合征[6]等发面发挥了有效的作用，含有CTS的中成药如丹参酮胶囊、妇炎康片、丹蒌片等在临床中得到广泛的运用。有关CTS的单用以及合并用药等研究已有报道，然而其剂量研究却未见实验报道。本研究通过灌胃SD大鼠CTS，评价单剂量和多剂量给药后CTS在健康SD大鼠的药动学特性，探讨单剂量多剂量给药方式之间是否存在差异，为该药进一步在临床应用提供依据。
1.1 仪器
日本岛津LC-20A超高速液相谱仪 (日本岛津公司)：配置二元泵、系统控制器、自动进样器、柱温箱；API 4000-QTRAP型质谱仪(美国ABI/SCIEX公司)：配有电喷雾离子化源(ESI)、大气压化学离子化接口、三重四极杆质量分析器以及Analyst 1.5.2数据处理软件；XS-105型十万分之一电子天平 (瑞士 Mettler Toledo公司)；AS20500A型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；Millipore纯水系统 (美国Millipore公司)；Thermo超低温冰箱 (美国Thermo公司)；WH-3微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品及试剂
CTS，批号 110852-200305，规格 20 mg，纯度98%，购自中国药品生物制品检定所；内标（IS）： （DZP），批号115-9302，规格20 mg，纯度100%，购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈均为谱纯(美国TEDIA公司)；甲酸、吐温-80、乙酸铵、无水乙醇等均为分析纯，购自中国医药集团总公司；水为去离子水；其它试剂均为分析纯。
2.1 谱及质谱条件
液相条件：谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm，美国Agilent Techn
ologies公司）；流动相4 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈 (15∶85，v/v)，流速1 mL/min；等度洗脱5 min；进样量20μL；柱温30℃；进样器温度4℃。
质谱条件：离子检测方式多重反应监测（MRM）；离子极性正离子（Positive）；离子化方式电喷雾离子化（ESI）；离子对CTS m/z 297.3→251.2；内标m/z 285.2→193.1；传输电压103 V（CTS）、98 V（IS）；碰撞能量33 eV（CTS）、43 eV（IS）；干燥气温度350℃；干燥气流速10 L/min；雾化室压力50 psi；毛细管电压5 000 V。
2.2 对照品溶液的配置
精密称取CTS对照品5.0 mg，置于10 mL棕容量瓶内，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.49 mg/mL的CTS储备液，取储备液适量，依次稀释至所需浓度。精密称取内标2.5 mg，加乙腈溶于10 mL棕容量瓶内，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.25 mg/mL的内标储备液，取适量储备液用乙酸乙酯配置成0.4 ng/mL的溶液，作为内标溶液备用。
步进电机驱动器2.3 血浆处理方法
将血浆从-80℃取出，37℃解冻，振荡5 min，用移液精密吸取血浆样品100μL加入1.5 mL EP管中，并加入含 0.4 ng/mL内标的乙酸乙酯800μL，涡旋混匀3 min，静置10 min，4℃ 12 000 r/min高速离心10 min，吸700μL上清，于60℃氮气挥干，加100μL乙腈复溶，涡旋混匀，12 000 r/min离心10 min，吸取上清，进行LC-MS/MS分析。
2.4 动物实验方案
2.4.1 实验动物 6～8周龄SPF级SD雄性大鼠20只，体质量（220±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2014-0002，饲养于上海中医药大学实验动物中心，自由饮水、饮食。
2.4.2 实验用药配制 精密称取CTS标准品适量，吐温-80、超声振荡器超声助溶，用生理盐水溶解并定容至浓度为2 mg/mL的混悬液，置4℃冰箱中保存，备用。
2.4.3 动物分组及给药 将20只SD大鼠随机分为单剂量组、多剂量组两组，每组10只。
单剂量组：前9天每天予生理盐水（含10%吐温-80）灌胃，灌胃剂量为5 mL/kg（剂量换算与灌胃CTS体积相当），第10天以10 mg/kg灌胃含有CTS的生理盐水混悬液，每天每只大大山里的土家娃
鼠给药量不超过2 mL。末次给药前空腹取血后再灌胃，并按如下时间点进行采血取样：0、10、20、30、45 min，1、1.5、2、3、4、8、12、24 h。至大鼠眼底静脉窦取血0.3 mL，肝素钠100μL抗凝，放置片刻后室温下4 000 r/min离心10 min，分离血浆，于-80℃保存待测。决策支持系统
多次给药组：每天按10 mg/kg的剂量连续灌胃含有 CTS的生理盐水混悬液 （含吐温-80）10 d，每天每只大鼠给药量不超过2 mL。末次给药前空腹取血后再灌胃，余下不同时间点采血取样等操作同单剂量组。上述两组动物整个实验过程中不禁水，给药前禁食12 h，给药后2 h给予食物。
3.1 分析方法验证
3.1.1 方法专属性 在“2.1”项下的谱和质谱条件下，分别将空白血浆以及实验大鼠给药后的血浆样品按“2.3”项下方法处理后，进样，记录谱图。由图1可见，CTS（保留时间3.44 min）和DZP（保留时间2.11 min）峰形良好，血浆中内源性物质对测定干扰不明显。
3.1.2 标准曲线 取1.5 mL的EP管数支，分别精密加入不同量的CTS标准液，加入空白血浆
0.1 mL，涡旋混匀，配成含CTS浓度分别为0.1、0.25、0.625、1.5、2.5、7.5、15 ng/mL的标准含药血浆。按“2.3”项下方法处理，进样，记录谱图。计算以血浆中CTS的浓度C为X轴，CTS峰面积AS和IS的峰面积Ai比值f（AS/Ai）为Y轴，采用加权（1/ x2）最小二乘法分别进行线性回归，CTS的标准曲线回归方程为：f=0.006 03X+0.000 05，r=0.999 6，n= 7，线性范围 0.1～15 ng/mL。最低定量下限为0.1 ng/mL。
3.1.3 精密度和准确度 依“3.1.2”方法精密配制含CTS浓度分别为 0.2 ng/mL（低）、2.5 ng/mL（中）、15 ng/mL（高）的标准含药血浆，每个浓度平行5份，并制备随行标准曲线，按“2.3”项下方法处理，进行检测，并于3 d内重复测定得到日间精密度，将所测定的结果进行t检验（P＞0.05），无统计学意义，计算精密度（RSD）和准确度，结果见表1。
3.1.4 介质效应和提取回收率 以CTS的0.2 ng/mL（低）、2.5 ng/mL（中）、15 ng/mL（高）3种浓度考察CTS的介质效应，结果见表2，其结果表明CTS和IS无明显的介质效应。取含CTS浓度为0.2 ng/mL（低）、2.5 ng/mL（中）、15 ng/mL（高）3种浓度的标准含药血浆，按照绝对回收率方法处理后进样。3种血药浓度的绝对回收率结果见表2。
3.1.5 稳定性试验 取低（0.2 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（15 ng/mL）的CTS标准含
中小企业家
药血浆，分别在4、12 h测定以考察CTS的稳定性；反复冻融稳定性：同法配制低中高3种浓度的血浆样品各5份，置于-20℃冰箱冷冻，后拿出融化，反复3次，并按照前法分别加以测定；长期冷冻：将血样放置-80℃保存30 d后按前法配置3种浓度的CTS标准含药血浆后进行检测。
以上稳定性的检测结果无明显改变。
3.2 药代动力学研究
3.2.1 血药浓度-时间曲线 20只SD大鼠随机分组灌胃CTS后，采取血浆经LC-MS/MS分析后，发现CTS呈双峰吸收，与大多数药物在体内的药时曲线模式一致，即经过首过效应后药物的吸收曲线呈双峰现象。单剂量和多剂量组给药后CTS的平均血药浓度-时间曲线见图2。
3.2.2 药代动力学参数 单剂量灌胃CTS后，10只SD大鼠血浆中的CTS的Cmax为（12.16±14.11）ng/mL，AUC0～t为（58.40±25.73）ng·h/mL，Tmax为（2.88±2.56）h，主要药动参数结果见下表3。10只大鼠多剂量灌胃CTS后，平均稳态血药浓度为Cav为
（1.95±0.61）ng/mL，稳态血药浓度-时间曲线下面积 AUCss为 （46.74± 14.51）ng·h/mL，波动度DF为2.42±0.28，多剂量灌胃CTS后的主要药动学参数结果见表3。
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