摘要：卵黄抗体(Yolk Immunoglobulin，IgY)是蛋鸡受特定抗原刺激后体内会产生特异性并被转移和贮存在卵黄中的免疫球蛋白。 用鸡卵黄大量生产和制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。IgY可作为替代抗生素的新型绿饲料添加剂。本文就免疫鸡卵黄抗体在猪生产中的应用作一综述。 关键词 卵黄抗体；猪生产；应用
卵黄抗体作为一种新型绿添加剂有其自身的优势：①卵黄抗体产量高，Anders(1993)推算认为一只蛋鸡每周的抗体产量相当于9～10只小白兔的抗体产量；②鸡蛋的生产成本较低，收集和提纯方便，大规模提取抗体的技术已经成熟；③产生有效免疫反应所需抗原量小；④IgY的化学性质稳定，具有一定的耐热、耐酸、耐碱及耐高渗性能，对胃蛋白酶具有良好的抵抗能力；⑤由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应；⑥不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果；⑦对肠道正常菌无副作用，也不存在抗药性和药物残留问题。IgY本身是一种优质的蛋白源，有促生长作用。 1．卵黄抗体(IgY)
1.1 IgY抗体结构
IgY大分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。Warr等(1995)[1]通过分子结构分析认为IgY是哺乳动物体内IgG 和IgM 的进化前体。IgY 中Cυ3和Cυ4区与哺乳动物IgG 的Cγ2和Cγ3具有同源性；Cυ2是IgY的枢纽区，而它在IgY 中没有得到充分进化。IgY中这种不发达的枢纽区造成了Fab部分的低活性，而这进而可能是IgG 与IgY某些差异的原因。与IgG一样，IgY山东明水汽车配件厂的Fc片断是绝大部分生物受动器功能的作用部位。IgY-Fc部分包括2条碳氢链，而IgG 只有一条。IgG在重链上含有3个功能域而IgY爱情请你等等我的重链含有4个功能域，而且IgY缺少铰链区。
1.2 IgY进入卵黄的机制
禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgY)在卵细胞中逐渐蓄积。IgY通过受体调节作用 ，它只
允许母源血液中存在的IgY选择性地向卵黄转移，转运量与其在血清中的浓度相关，该转运对不同IgY 的次级成分没有差异性。当卵细胞分泌进入输卵管时，流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中，形成卵清抗体。Losc．h(1986)证实只有少量的IgA 和IgM 经输卵管从血细胞转运到鸡蛋白部分。
2 卵黄抗体在猪生产中的应用
2.1.1 仔猪大肠杆菌性腹泻机制
仔猪大肠杆菌腹泻是产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一。大肠肝菌致病因子包括：粘附素(adhension)、肠毒素(Enterotoxins)、水肿病毒素(edema disease principle,EDP)、内毒素(endotoxin)、溶血素(haemolysin)以及最近发现的EatA[2]。其中ETEC引起仔猪腹泻的主要致病原是具有宿主特异性的粘附素和肠毒素。ETEC粘附素实质上是一种菌毛蛋白又称为定居因子(CFAS)。Conway(1990，1991)认为与小肠黏膜上的受体结合是ETEC致病过程中的重要
环节。仔猪的肠道黏膜上皮细胞表面具有多种能与ETEC特异性粘附素结合的受体。ETEC宿主特异性菌毛粘附素有20多种，引起仔猪腹泻的主要是K88(F4)、K99(F5)、987P(F5)、F41等。ETEC菌毛抗原能够识别特定受体并与之结合使菌体能够抵抗肠道蠕动产生的冲刷作用从而定植下来，大量增殖并产生肠毒素（耐热肠毒素、不耐热肠毒素、志贺毒素2e、肠管凝集耐热肠毒素）。
耐热肠毒素(ST)与神经节苷脂(GM1)结合激活肠粘膜细胞表面的鸟苷环化酶(GC)，使胞内cGMP含量增多从而导致腹泻；不耐热肠毒素(LT)与GM1结合后激活肠上皮细胞的腺苷酸环化酶，使细胞中cAMP水平升高，进而导致肠粘膜细胞对水和Na+ 、Cl-、HCO3-等过度分泌至肠腔引起腹泻[3]。
2.1.2 IgY抑制大肠杆菌菌毛粘附素与小肠黏膜受体结合的作用机制
可包括一下几个方面：①特定病原菌卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；②卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；③一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这
些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。Jin (1998)[4]用抗菌毛卵黄抗体处理后的大肠杆菌在体外与小肠上皮细胞的进行吸附试验，结果表明大肠杆菌在小肠黏液的吸附受到明显的抑制。但试验表明随着E. coli浓度的提高，抑制效果明显降低，说明lgY作用的发挥具有量依赖性。
Yokoyama(1992)[5]将提纯的ETEC的K88、K99、987P制成单价菌毛蛋白苗，免疫蛋鸡获得卵黄抗体粉末，EIISA检测结果表明，抗K88冲动控制障碍、K99、987P的卵黄抗体能够特异性地与相应的菌毛抗原作用。用卵黄抗体对不同ETEC菌株攻毒的新生仔猪进行口服，组仔猪全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80％ 。高云英(2003)[6]用ETEC的K88、K99、987P标准菌株和地方分离菌株制成多价菌体卵黄抗体经预防、攻毒试验及临床效果观察，对新生仔猪免疫保护率可达90％ 以上，3日龄仔猪攻毒保护率达98％ 以上，3—11日龄仔猪临床治愈率达95％ 以上。
2.1.3 影响卵黄抗体防治仔猪腹泻效果的因素
抽水蓄能
①菌体与菌毛抗原。以菌体为抗原制备菌体疫苗，制作虽然方便但免疫效果不如菌毛抗原制备的菌毛蛋白苗效价高(肖驰等1998)[7]， 试验还显示卵黄抗体对仔猪黄痢的治愈率高于庆大霉素、土霉素和痢特灵。;②卵黄抗体的剂量和ETEC的浓度。小肠内所含抗体须达到一定剂量才能阻止E．coli粘附到小肠粘膜上皮细胞的受体上。③采用卵黄抗体进行应具有连续性，例如：每只仔猪每天饲喂1.5g的卵黄抗体能有效防治社会经济1010 cfu／mL ETEC引起的腹泻，在饲粮中添加0．2％的卵黄抗体可预防商业性猪场中仔猪腹泻[8]。
2.1.4 卵黄抗体在猪肠道内的变化规律
对于新生仔猪，卵黄抗体能在肠道内能被有效吸收并被主动转运至循环系统，其吸收通道大约在出生后34h关闭。卵黄抗体在血清中的半衰期大约只有1．85天。抗体在0，3，6，21日龄的24h内都保持一定滴度，表现出卵黄抗体对胃酸和消化酶有良好的耐受性(Yokoyama,1992)。随着仔猪日龄的增加，其消化系统逐步发育完善，使得胃酸pH值降低和消化酶活性提高，卵黄抗体(IgY)分子在这种环境下结构易被破坏而失去活性。结合许多饲养试验结果，卵黄抗体在4～5周龄仔猪肠道内仍能保持相当高的稳定性。因此，对于3～4周龄的断奶仔猪，用卵黄抗体防治细菌感染能保证其有效性。
2.2 卵黄抗体在猪防治其它疾病中的应用
刘湘新等(2004)[9]采用猪链球菌活疫苗(ST17I株)免疫鸡制作卵黄抗体，免疫效价达到1：1024，血凝抑制效价为cam71：1600，并且高免蛋可在7~30d维持。白静等(2006)[10]用猪瘟兔化弱毒苗免疫鸡制得抗猪瘟高免卵黄抗体(免疫效价为1:32~1:64)应用于临床并取得了良好效果。
2.3 IgY在猪病诊断方面的应用
卵黄抗体和哺乳动物免疫球蛋白有许多不同之处，如它不与金葡萄球菌A蛋白结合，不与哺乳动物Fc受体结合，对哺乳动物补体无固定作用等，这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，所以卵黄抗体可以应用于免疫荧光试验、ELISA试验、免疫扩散、免疫电泳等疾病检测手段上[11]。胶乳凝集试验是将可溶性抗原(或抗体)吸附于聚苯乙烯胶乳载体颗粒的间接凝集试验。根据此原理，将胶体金标记抗体固定于特制的载体，则为免疫金标记法。这种方法简便、快速、敏感、特异，广泛用于疾病的快速诊断。试验中常用的抗体是哺乳动物IgG。但聚苯乙烯胶乳吸附蛋白质存在结合不牢固的问题，影响了
检测效果。由于IgY具有更高的特异性和敏感性，可用IgY代替IgG作胶乳凝集试验及制作胶体金。
3． 卵黄抗体制备技术研究
3.1 影响鸡的免疫效果和抗体浓度的主要因素
①抗原剂量 能明显影响免疫效果和抗体浓度。不同抗原的最佳免疫用剂量应该通过具体实验获得。一般而言，小抗原可能需要用大剂量，或与载体(氨基酸)偶合；②佐剂的使用 弗氏完全佐剂(FCA)仍是最有效的佐剂；③抗原的施用途径 最常用肌肉注射(im)；④免疫程序 免疫间隔过短会造成免疫效果的抑制，而长间隔的免疫效果更佳（前两次抗原注射的间隔至少4wk）[12]。
3.2 IgY的提纯
通过纯化提取卵黄抗体，可消除垂直传播疫病的危险性，同时可免除卵磷蛋白等大分子物质的副作用。提纯可以分为以下几类：(1)沉淀法：有氨基酸盐或硫酸钠法、聚乙烯醇(PEG)法、辛酸法、水溶解法、硫酸葡聚糖沉淀法 (2)谱层析法：有亲和层析法、离子交
换谱法、疏水作用谱法。此外还有超声过滤法等。
近来PEG法成为最常用和最高效的提取方法。Polson(1980)[13]首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法，分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀，用硫酸铵盐析法去除PEG。随后人们在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法，使产量提高，而且能有效地去除残留PEG。
水稀释法也是常用的有效手段，Akita(1992)[14]等用该法提纯IgY，每个卵黄可获得100mg以上的IgY。此后，Akita等比较了水稀释法法、PEG法、硫酸葡聚糖沉淀法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果，结果表明：WD法产量最高，其次为硫酸葡聚糖沉淀法，WD法更适合大规模生产。
3.3 冷冻干燥或喷雾干燥
冷冻干燥技术可将纯化的抗体在预先冷冻的状态下，不经液态直接升华除去水分而获得干粉型制剂，它避免了液态下保存的抗体易失活易变形的缺点，能够长时间保存。胡晓苗(2006)
采用冷冻真空干燥机以浓度5%的蔗糖为冻干干燥剂将纯化的IgY制成冻干卵黄抗体，结果表明冻干前后效价不变，而且对温度耐受力显著增强。但是由于设备和化学试剂的因素导致生产成本较高。
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