昆虫学报Acta Entomologica Sinica ,N ovember 2008,51(11):1196-1209ISS N 045426296 基金项目：浙江省自然科学基金项目(Y 3080031)；国家自然科学基金项目(30270899)；国家“973”计划项目(2006C B102005)
作者简介：董胜张，男,1979年6月生，安徽六安人，博士，研究方向为昆虫生理生化与分子生物学,E 2mail :dong -shzhang @1631com 3通讯作者Author for correspondence ,E 2mail :chu @zju.edu 收稿日期Received :2008206210；接收日期Accepted :2008210221 董胜张
1,2
，叶恭银
2,3
，刘朝良
3
(11中国计量学院生命科学学院，杭州 310018;21浙江大学昆虫科学研究所，杭州 310029;31安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036)
摘要：卵黄原蛋白(Vg )、卵黄多肽(Y P )和小卵黄蛋白(minor Y P )是昆虫三类主要的卵黄蛋白，它们之间的同源性一直是研究的重点。本文根据已经解析的Vg ,Y P 和minor Y P 的氨基酸序列，采用序列比对和系统树分析的方法，并结合国内外对三者同源性研究的基础，对其进化关系进行了分析。结果表明,Vg ,Y P 和minor Y P 是三类具有不同进化祖先的卵黄蛋白，它们的氨基酸序列相似性较低。Vg 在系统进化过程中最为保守，与人类的血清载脂蛋白B (ApoB )具有较高的同源性;Y P 与脊椎动物的肝脂酶和胰脂酶具有较高的同源性；而minor Y P 与脊椎动物胃脂肪
酶和舌脂肪酶具有较高的同源性。同时，对三者的分子特性做了简单的介绍。关键词：卵黄原蛋白；卵黄多肽；小卵黄蛋白；分子进化；系统发育分析中图分类号:Q963 文献标识码:A 文章编号:045426296(2008)1121196214
R esearch progress in molecular evolution of yolk proteins in insects
DONG Sheng 2Zhang
1,2
,YE G ong 2Y in
2,3
,LI U Chao 2Liang 3
(11C ollege of Life Sciences ,China Jiliang
University ,Hangzhou 310018,China ;21Institute of Insect Sciences ,Zhejiang University ,Hangzhou 310029,China ;31C ollege of Life Sciences ,Anhui Agricultural University ,Hefei 230036,China )Abstract :Vitellogenins ,cyclorraphan y olk polypeptides and lepidopteran minor y olk proteins are main three classes of y olk proteins in insects ,and ev olutionary relationships am ong them are always the key problems for study.This paper explored the m olecular ev olution relationships within and am ong three y olk proteins based on their sequence data retrieved from the NC BI protein database through alignment and phylogenetic analysis.C ombined with what have been achieved for their ev olutionary relationships ,we concluded that vitellogenins are well conserved in insects ,showi
ng similarity to the vertebrate apolipoprotein B ;y olk polypeptides are related to vertebrate hepatic and pancreatic lipases but lost their functions in phylogenesis ,while minor y olk proteins are related to a family of lipases containing vertebrate gastric lipases and lingual lipases.In addition ,m olecular characteristics of three y olk proteins were als o summarized.
K ey w ords :Vitellogenin ;y olk polypeptides ;minor y olk protein ;m olecular ev olution ;phylogenetic analysis
卵黄蛋白(y olk protein )是指许多卵生脊椎动物和无脊椎动物卵黄发生时沉积在卵内，且在胚胎发育时作为营养源被利用的卵内贮藏蛋白。昆虫卵黄蛋白主要是由雌性脂肪体合成，然后分泌到血淋巴中，被正在发育的卵母细胞所摄取；或直接由卵巢合成，在卵内与外来的蛋白一起形成卵黄颗粒，然后被卵内蛋白酶水解为小分子的多肽或氨基酸，作为胚胎发育时的营养来源(K unkel and N ordin ,1985;Raikhel and Dhadialla ,1992;G iorgi et al .,1999;S wdvers et al .,2005)。根据已经报道的昆虫卵黄蛋
白的性质和进化关系，可将其归纳为3种主要类型：卵黄原蛋白(vitellogenin ,Vg )、卵黄多肽(y olk
polypeptides ,Y P )和小卵黄蛋白(minor Y P )(Hens et al .,2004)。此外，还存在一些不常见或卵内含量较少的卵黄蛋白，如微卵黄原蛋白(microvitellogenin ,mVg )，主要存在于鳞翅目昆虫中，它是一种
分子量约为30kD 的卵黄蛋白(K aw ooya et al .,1986;Pan et al .,1994)；脂蛋白(lipophorin ,Lp )，在美国白蛾
Hyphantria cunea 卵中，该蛋白是仅次于Vg 的卵内主
要蛋白之一(Y un et al .,1994)；印度竹节虫
Carausius morosus 脂肪体合成的分子量约为85kD 的
蛋白(Fausto et al .,2005)等。
Vg是一类大分子量的糖脂复合蛋白，广泛存在于卵生脊椎动物和非脊椎动物的血淋巴、肝脏(脂肪体)和卵中。Y P主要存在于高等双翅目昆虫的卵中，一般由几个分子量约为45kD左右的多肽组成，且在进化上完全不同于Vg。minor Y P主要存在于某些鳞翅目昆虫中，在进化上与Vg没有同源性，而与脊椎动物的脂酶具有较高的同源性(Hagedorn et al.,1998;Sappington and Raikhel,1998)。关于这三类卵黄蛋白的分子进化一直是科学家研究和争论的焦点，尤其是Y P和minor Y P之间的进化关系。Sappington等(2002)认为双翅目的Y P和鳞翅目的minor Y P具有较高的同源性，均与脊椎动物的脂酶具有同源性，因此推测它们来自于同一个祖先；而Hens等(2004)不同意此观点，认为两者不具有同源性，来自于不同的祖先。本文就这三者之间的进化关系和各自的分子进化进行分析与研究。
1 卵黄原蛋白(V g)
111 分子特性
在大部分昆虫中,Vg是卵黄蛋白的前体，它由雌性脂肪体在激素的调控下合成，分泌到血淋巴，被卵母细胞通过受体调节的内吞作用所摄取，经修饰、切除、加工后以晶体形式沉积为卵黄磷蛋白(vitellin,Vt)。Vg和Vt具有相似的分子量、氨基酸组成及免疫特性(Hagedorn and K unkel,1979;K unkel and N ordin,1985)。Vg是一类大分子量的糖脂复合蛋白，约含1%～14%的糖类,6%～16%的脂及大约84%的氨基酸(K unkel and N ordin,1985)。Vg的糖类主要为甘露糖(mannose)，以寡聚甘露糖的形式存在，由其形成的寡聚糖链在滤泡细胞识别Vg的过程中起着重要作用，同时Vg中的糖类可在一定程度上加强其稳定性(李乾君等,1995)。脂类主要包括中性脂、甾醇及磷脂等，但有些昆虫如臀纹粉蚧Dactylopius conf uses的Vg不含脂类(Z iegler et al., 1996)。昆虫Vg的氨基酸序列、结构和组成与其他卵生动物都具有较高的保守性，它们都来自于同一个祖先蛋白(Chen et al.,1994;Sappington and Raikhel,1998;Sappington et al.,2002)。大多数昆虫Vg的等电点(pI)为611～613。
昆虫Vg由6～7kb的mRNA编码而形成分子量约为200kD的前体蛋白，其氨基酸序列，通常含有几个比较保守的结构域或氨基酸基序(m otif)，如多聚丝氨酸区(polyserine domains)、G LΠICG、RXXR和C2端的半胱氨酸等(Sappington and Raikhel,1998)。昆虫Vg前体通常被体内的类似枯草杆菌素的原蛋
白内切酶(subtilisin2like proprotein endoproteases)，即转化酶(convertase)特异性识别。这些酶识别一种保守的基序，即(RΠK)XX(RΠK)，其存在于所有已经解析的昆虫Vg氨基酸序列中(Sappington and Raikhel, 1998;Sappington et al.,2002;Tu fail et al.,2004)。埃及伊蚊Aedes aegypti Vg转化酶(vitellogenin convertase,VC)一级结构已经从其卵黄发生时的脂肪体细胞中被解析，它是人类和果蝇的弗林蛋白酶(furins)和一种果蝇的转化酶的同源物，且已证实了其参与Vg前体的裂解(Chen and Raikhel,1996)。根据Vg前体是否被转化酶分解或分解后亚基组成和分子量的大小，可以将昆虫分为三类。第一类,Vg 的前体只含有一个大分子量的亚基，没有被内切酶所水解，主要包括一些膜翅目昆虫，如木工蚁Camponotus festinates(Martinez and Wheeler,1991)、日本瘤姬蜂Pimpla nipponica(N ose et al.,1997)、蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum(D ong et al.,2007)、意大利蜜蜂Apis mellifera(Piulachs et al.,2003)和丽蚜小蜂Encar sia formosa(D onnell,2004)等。以及少量的鳞翅目昆虫，如柞蚕Antheraea pernyi(Liu et al., 2001)和草地夜蛾Spodoptera frugiperda(S orge et al., 2000)等。第二类,Vg前体被酶切为一个大分子量的亚基(>160kD)和一个小分子量的亚基(<60 kD)，包括绝大多数的完全变态昆虫，如家蚕Bombyx mori(Y ano et al.,1994)，蓖麻蚕Philosama cynthia ricin(刘朝良等,2003)，德国小蠊Blattella germanica (C omas et al.,2000)等。第三类,Vg前体被酶解为几个分子量约为80～110kD的多肽，主要包括不完全变态昆虫，如棒蜂缘蝽Riptortus clavatus(Hirai et al.,1998)、东亚飞蝗Locusta migratoria(Wyatt, 1988)、马德拉蜚蠊Leucophaea maderae(della Cioppa and Engelmann,1987)和美洲大蠊Periplaneta americana(K im and Lee,1994)等。
高坠
昆虫Vg序列中的多聚丝氨酸区域多位于N2末端，也有少数位于C2末端，其位置相对保守。多聚丝氨酸区域的个数在昆虫中也是不相同的。有些昆虫不含有，如棉铃象甲Anthonomus grandis(T rewitt et al.,1992)、舞毒蛾Lymantria dispar(Hiremath and Lehtoma,1997)、日本瘤姬蜂(N ose et al.,1997)、蝶蛹金小蜂(D ong et al.,2007)；有些昆虫含有1个，如红火蚁Solenopsis invicta Vg2和Vg3(T ian et al., 2004)、野桑蚕Bombyx mandarina M oore(董胜张等,
www.ddd207911
11期董胜张等：昆虫卵黄蛋白分子进化的研究进展
2004)等；有些昆虫含有2个，如菜叶蜂Athalia rosae (K ageyama et al.,1994)、家蚕(Y ano et al.,1994)等；而有些昆虫含有3个，如埃及伊蚊(Chen et al., 1994)等。一般认为多聚丝氨酸区是通过丝氨酸密码子的一系列扩增而形成的，一般位于进化速率较高的区域，与卵生脊椎动物卵黄高磷蛋白(phosvitin)区同源性较高，认为是一些激酶(如磷酸化激酶)的底物(Sappington and Raikhel,1998)。
高中英语写作教学通过对已经解析昆虫Vg和非昆虫的Vg氨基酸序列的比对分析发现,Vg序列中有5个区域(subdomainⅠ-Ⅴ)较其他区域具有较高的保守性，这5个区域中氨基酸的同源性明显高于其他部分(Chen et al.,1997;Sappington et al.,2002)。此外，比对结果表明昆虫Vg序列中的多聚丝氨酸区及其上游和下游序列的同源性明显的低于其他部分。
在不同的昆虫中，编码Vg前体基因的个数是不同的，虽然大部分已经报道的昆虫仅含有1个6～7 kb的Vg mRNA，但有些昆虫中含有几个Vg的基因。如埃及伊蚊就含有5个不同的Vg基因(Chen et al., 1994;R omans et al.,1995)，小珀蝽象Plautia stali(Lee et al.,2000)和红火蚁(T ian et al.,2004)均含有3个Vg基因，而棒蜂缘蝽(H irai et al.,1998)和东亚飞蝗(W yatt,1988)均含有2个Vg基因。
112 分子进化
昆虫Vg和非昆虫Vg(如脊椎动物、线虫等)与人类的血清载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)进化上同源，可能起源于共同的祖先，同属于低密度脂蛋白家族(low density lipoprotein,LD L)。以前的研究中发现，昆虫Vg与脊椎动物、线虫、鱼虾Vg进化关系上较远，在系统进化树上聚类在不同的分支上，而昆虫Vg聚类在一个独立的分支上，从而推测这种进化关系可能反映了昆虫Vg与其他动物的近缘关系较远或者在其它动物分化之前已经开始形成(Sappington and Raikhel,1998)。然而，随着越来越多昆虫Vg基因序列被解析和报道(表1)，以及分子进化研究方法与计算方法的改进，因此对昆虫Vg分子进化的研究更能反应物种之间的进化速率和进化关系，丰富人们对昆虫进化的认识。
为了研究昆虫Vg分子进化，我们首先对已经解析昆虫Vg的一级结构(氨基酸序列)采用Clustal W (Thom ps on et al.,1994)进行比对分析，然后分别采用独立元素法(discrete character methods)中的邻位相连法(neighbor2joining methods,N J)和距离依靠法(distance methods)中的最大简约法(maximu
m parsim ony method,MP)构建系统发育进化树。系统树构建的软件是MEG A version311(K umar et al., 2004)，参数的设定为软件的缺省数值。并设立了11种非昆虫卵生动物Vg作为外参考。两种方法构建的系统树基本相似(图1,2)，但是N J树的结果与昆虫的传统分类地位更为接近。N J树和MP树的相同之处是每个目的昆虫都聚类在同一分支中，鳞翅目昆虫在聚类树上的最外端。最明显不同的是鞘翅目昆虫，在N J树中，它是最后被独立的，而在MP树中，它是在鳞翅目昆虫之后被独立的。另外一个明显的不同之处是不完全变态昆虫中的蜚蠊目、半翅目和同翅目昆虫在N J树中能够聚类一个独立单元，而在MP树中聚类在不同的独立单元。因此，我们推测昆虫Vg的保守性在目与目之间具有较高的保守性，而同一目中的不同科昆虫Vg之间的保守性还需要进一步的研究。此外，昆虫Vg与其它非昆虫Vg形成了不同的类，尤其与线虫Vg的亲缘关系最远，这与传统动物分类地位基本一致。
2 卵黄多肽(YP)
211 分子特性
二苯并噻吩卵黄多肽(Y P)是指在高等双翅目昆虫中，功能等同于其他昆虫Vg的几个分子量约为45kD的多肽，且这些多肽在进化上完全不同于其他昆虫Vg (Sappington and Raikhel,1998)。Y P通常是在卵巢的滤泡细胞中合成，但在有些双翅目昆虫中，雌虫的脂肪体也能合成。而且,Y P蛋白和Y P基因在脂肪体和卵巢滤泡细胞中的合成与表达含量是不同的。红头丽蝇Calliphora erythrocephala的卵巢合成51kD和49k
D两种Y Ps，而脂肪体中能分泌一个46kD的Y P 和另外一个不同的49kD的Y P(F ourney et al., 1982)。黑腹果蝇Drosophila melanogaster的体内存在3种Y Ps，脂肪体和卵巢滤泡细胞均能合成这3种多肽，但是这3种多肽在不同组织中的合成比例是不同的，滤泡细胞合成的Y P1和Y P2约占其总量的35%，而Y P3只占10%左右(Isaac and Bownes, 1982)。果蝇Drosophila grimshawi的体内也存在3种Y Ps，卵巢内合成的Y P2比脂肪体多，合成的Y P1较少，而Y P3几乎不存在；相反，脂肪体合成的Y P1最多，而Y P2和Y P3较少(K ambysellis et al.,1986)。这些Y P在脂肪体中合成后，在被卵巢吸收的同时通常发生糖基化、磷酸化和酪氨酸硫酸化修饰。已经报道的双翅目昆虫YP基因如表2。从表中可以
8911昆虫学报Acta Entomologica Sinica51卷
看出，昆虫YP 基因序列含有400～450个氨基酸残基，推测其翻译后的分子量约为40～50kD 之间。这些YP 基因的氨基酸具有较高的同源性，且与脊
椎动物脂酶相似性较高，但与昆虫Vg 的同源性较低(Bownes et al .,1988;Hagedorn et al .,1998)。金元外交
mmpp
表1 昆虫和非昆虫卵生动物的V g 基因序列
T able 1 A list of V g genes of insects and non 2insect ovip arous anim als
种类S pecies Vg 基因G enBank 登录号G enBank accession no.of Vg gene 参考文献References
昆虫Insects 蜚蠊目Blattodea 德国小蠊Blattella germanica A J005115C omas et al .,2000 马德拉蜚蠊Leucophaea madera Vg1:AB052640;Vg2:AB194976Tu fail and T akeda ,2002 美洲大蠊Periplaneta americana Vg1:AB034804;Vg2:AB047401Tu fail et al .,2000,2001同翅目H om optera 大褐蝉Graptopsaltria nigro fuscata AB026848Lee et al .,2000 琉璃叶蝉Homalodisca coagulata DQ118408Hirai et al .,1998半翅目Hem iptera 小珀蝽象Plautia stali Vg1:AB033498;Vg2:AB033499;Vg3:AB033500Lee et al .,2000 棒蜂缘蝽Riptortus clavatus U97277Hirai et al .,1998鞘翅目C oleoptera 棉铃象甲Anthonomous grandis M72980T rewitt et al .,1992 黄粉虫Tenebrio molitor AY 714212W arr et al .,2006双翅目Diptera 埃及伊蚊Aedes aegypti Vg1:U02548;Vg2:AY 380797;Vg3:AY 373377Chen et al .,1994 白端按蚊Anopheles albimanus AY 691327- 冈比亚按蚊Anopheles gambiae Vg1:AAF82131;Vg2:AAF82132- 印度按蚊Anopheles stephensi DQ442990- 致倦库蚊Culex pipiens quinque fasciatus Vg1:AY 691324;Vg2:AY 691325- 伊蚊Ochlerotatus atropalpus Vg2:AY 691321:Vg3:AY 691322- 安汶巨蚊Toxorhynchites amboinensis AY 691326-鳞翅目Lepidoptera 柞蚕Antheraea pernyi AB049631Liu et al .,2001 天蚕Antheraea yamamai AB055843刘朝良,2006 野桑蚕Bombyx mandarina AB055845董胜张等,2004 家蚕Bombyx mori D13160Y ano et al .,1994 舞毒蛾Lymantria dispar U90756Hiremath and Lehtom
a ,1997 樟目天蚕Saturnia japonica AB190809-膜翅目Hymenoptera 意大利蜜蜂Apis mellifera A J517411Piulachs et al .,2003 菜叶蜂Athalia rosae AB007850K ageyama et al .,1994 丽蚜小蜂Encar sia formosa AY 553878D onnell ,2004 日本瘤姬蜂Pimpla nipponica AF026789N ose et al .,1997 红火蚁Solenopsis invicta Vg1:AF512520:Vg2:AY 941795:Vg3:AY 941796T ian et al .,2004 蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum EF468683Y e et al .,2008非昆虫卵生动物N on 2insect oviparous animals 秀丽线虫Caenorhabditis elegans X56213S pieth et al .,1991 星康吉鳗Conger myriaster AB185334M ikawa et al .,2006 鲤鱼Cyprinus carpio AB106873- 银鸥Larus argentatus AY 045719Lorenzen et al .,2001 黑线鳕Melanogrammus aegle finus AF284034Reith et al .,2001 虹鳟Oncorhynchus mykiss X92804- 中华青 Oryzias latipes AB064320- 真鲷Pagrus major AB181838- 斑点 Rivulus marmoratus AY 279214- 条斑星鲽Verasper moseri AB181833- 非洲爪蟾Xenopus laevis AB092605-无参考文献出处的Vg 序列均直接从G enBank 中获得；下同。The full 2length data of those Vg genes without references are downloaded from G enBank (http :ΠΠw bi.nlm.nih.g ov Π
).The same below.9
91111期董胜张等：昆虫卵黄蛋白分子进化的研究进展
图1 采用邻位相连法构建的昆虫与非昆虫卵黄原蛋白(不包括信号肽)的系统发育树(序列信息见表1) Fig.1 The phylogenetic tree(neighbor2joining)for the entire amino acid sequence of Vg(excluding the signal peptide)
for the insects and non2insect animals as listed in T able1
结点上数字表示1000次重复的引导值。Numbers in the nodes correspond to bootstrap values in1000replicates.
212 分子进化
YP基因目前仅在高等双翅目昆虫中发现，且已经证实Y P与Vg是两种不同类型的卵黄蛋白，其中Y P与脊椎动物的肝脂酶(hepatic lipases)和胰脂酶(pancreatic lipases)具有较高的同源性，可能起源于共同的祖先。关于昆虫Y P与Vg的分子进化关系, Hagedorn等(1998)进行了系统的研究，但关于不同昆虫Y P之间的同源关系却未见相关报道。目前，已经报道且在G enBank中能够检索到YP的基因(表2)，其中省去部分与黑腹果蝇的近似种。对7种昆虫Y P一级结构的比对结果(图3)显示,Y P的一级结构中存在几个比较保守的区域，如Y H L, E VT VΠI,ITG LP,YI QRY和DVDFY等，且有几个保守的氨基酸序列，如G,FY和LΠVΠI，推测这些保区域和位点可能与Y P高级结构的形成有关。然而，由于YP基因存在多样性，因此根据Y P的氨基酸序列构建的N J和MP系统发育树(图4,5)出现较大的差异，与传统
的分类地位存在分歧。此外，即使同一种
0021昆虫学报Acta Entomologica Sinica51卷
图2 采用最大简约法构建的昆虫与非昆虫卵黄原蛋白(不包括信号肽)的系统发育树(序列信息见表1) Fig.2 The phylogenetic tree(maximum parsim ony)for the entire amino acid sequence of Vg(excluding the signal peptide)
for the insects and non2insect animals as listed in T able1
结点上数字表示1000次重复的引导值。Numbers in the nodes correspond to bootstrap values in1000replicates.
昆虫的不同YP基因的同源性也较差。因此，即使
YP基因存在一些较为保守的结构区域和保守位点，但也不能作为系统发育的参考对象。根据这些结果，可以推测YP基因编码的蛋白质主要作为结构和功能蛋白，已经失去其在系统进化中的功能和意义。3 小卵黄蛋白(minor YP)
311 分子特性
小卵黄蛋白(minor Y P)主要是指鳞翅目昆虫(蛾类)的卵内雌特异性蛋白(egg2specific proteins, ESP或称之为“Y P2”)，主要是在卵母细胞周围的上皮滤泡细胞中合成。目前已经在几种昆虫鉴定和克
1021
11期董胜张等：昆虫卵黄蛋白分子进化的研究进展
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