Vol．29，No．92013年9月
POLYMER MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING
Sept．2013
陈彰旭1，2，辛梅华1，李明春
1
（1．华侨大学材料科学与工程学院，环境友好功能材料教育部工程中心，福建厦门361021；
2．莆田学院环境与生物工程学院，福建莆田351100）
摘要：以1-（3-二甲氨基丙基）–3-乙基碳二亚胺为引发剂，N-羟基琥珀酰亚胺为催化偶联剂，将组氨酸接枝到壳聚糖上，通过改变组氨酸/壳聚糖的物质的量比及壳聚糖的相对分子质量制得不同取代度的N-组氨酸壳聚糖（NHCS ）。利用红
外光谱（FT-
IR ）、核磁共振（1
H-NMR ）、元素分析（EA ）、热重分析（TGA ）等进行表征。结果表明，随着组氨酸/壳聚糖的物质的量比增大，取代度增高，NHCS 支架材料孔径增大，孔径尺寸分布在5μm 120μm 之间，孔隙率均大于85%，可以满足组织工程支架材料的要求。随着pH 增大，NHCS 的Zeta 电位从+13．5mV 降至－22．7mV ，表明其具有pH 响应性。当组氨酸/壳聚糖的物质的量比为0.5时制得的NHCS 支架材料孔径均一，可为生物矿化提供良好的模板。关键词：组氨酸；壳聚糖；多孔支架中图分类号：O636．1
文献标识码：A
文章编号：1000-
7555（2013）09-0152-05收稿日期：2013-03-26基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（21103095）；福建省自然科学基金资助项目（2011J01312，
2012J01396）；福建省高校服务海西建设重点项目（2009HX11）
通讯联系人：李明春，主要从事功能高分子材料研究，E-
mail ：mcli@hqu．edu．cn 壳聚糖具有无毒、生物相容性和生物降解性好及
无免疫原性等优点，在组织工程中有广阔的应用前景。蔡志江等［1］
制备了具有良好生物相容性的细菌纤维素/壳聚糖复合多孔支架材料，有望用于组织工程支架等领域。另外，从仿生学考虑，壳聚糖由于分子链带有多种功能基团，并且具有良好的可塑性，常被用作固体基质模拟天然贝壳中的生物矿化及人体类似骨骼羟基
磷灰石的仿生合成
［2］
。组氨酸接枝壳聚糖有望调控
碳酸钙和羟基磷灰石的晶型、取向生长和形貌，可为进
一步探究不同pH 体系的生物矿化作用机理提供帮助。本文将组氨酸接枝到壳聚糖上（见Fig．1），并采用冷冻干燥法制备其支架材料，考察支架的外观形貌及孔隙率等，为其作为组织工程材料和仿生合成基质提供依据
。
Fig．1Preparation of Histidine Grafted Chitosan （NHCS ）
1实验部分1．1
主要试剂及仪器
壳聚糖（CS ）：珚M n =5．0ˑ104
Da ，
脱乙酰度（DD ）为95%；珚M w =1．0ˑ105Da 和5．0ˑ10
5
Da ，DD 为85%，山东海得贝海洋生物工程有限公司；L-组氨酸
工程管理（His ，＞99%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC ，＞98．5%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS ，＞98%）、2-（N-啉）乙磺酸（MES ，＞99%）：上海晶纯有限公司；其它试剂均为市售产品。
AVIII 600M 核磁共振仪：德国BRUKER 公司；
TENSON27红外光谱仪：德国BRUKER公司；S-3500N 扫描电子显微镜：日本日立公司；Vario MICRO元素分析仪：德国Elementar公司；SmartLab3kW X射线衍射仪：日本Rigaku公司；Zetasizer-3000HSA激光动态光散射仪：英国MALVERN公司。
1．2N-组氨酸壳聚糖（NHCS）多孔支架的制备参照文献［3］方法利用MES缓冲体系制备N-组氨酸壳聚糖多孔支架。称取l.00g相对分子质量为500KD、DD为85%的壳聚糖溶于100mL0.10mol/L MES缓冲溶液中（pH=5．5），加入壳聚糖单元物质的量1.4倍的EDC作缩合剂、壳聚糖单元等物质的量的NHS作偶联剂，搅拌均匀。再分别加入组氨酸/壳聚糖单元物质的量比为0．5、1、2和3的L-组氨酸，磁力搅拌室温反应24h。反应混合物蒸馏水透析5d（每天约更换蒸馏水4次），－50ħ冷冻8h后再真空冷冻干燥得组氨酸接枝壳聚糖，4种产物依次命名为NHCS-0．5、NHCS-1、NHCS-2、NHCS-3。改变CS相对分子质量为50KD和100KD，按照NHCS-2合成路线制备50KD-NH-CS-2及100KD-NHCS-2。
1．3N-组氨酸壳聚糖多孔支架的孔隙率测定
根据阿基米德排水（乙醇）法原理测定多孔支架的孔隙率和支架密度。在比重瓶中装满20mL的无水乙醇至刻度线，质量记为W1。将称量好的改性壳聚糖支架材料（W s）浸入无水乙醇中，抽真空至支架不再有气泡逸出，待充分饱和后放入上述比重瓶中，将超过刻度线的无水乙醇用滴管吸去至刻度，称其质量为W2，取出支架后称量比重瓶的质量为W3，分别按公式（1）和（2）计算改性壳聚糖支架的孔隙率p和支架密度ρ。
p=V
p /（V
p
dmso+V
s
）=（W
2
－W
3
－W
s
）/（W
1
－W
3
）（1）
ρ=W s/（（W3－W2）/ρ乙醇）（2）
2结果与讨论
2．1N-组氨酸壳聚糖的结构表征
通过偶氮显反应［4］检验产物中含有咪唑基团，说明组氨酸已接枝到壳聚糖上。
2．1．1N-组氨酸壳聚糖的FT-IR分析：采用KBr压片法测得NHCS的FT-IR如Fig．2所示。图中a是CS 的FT-IR谱线；b是组氨酸改性壳聚糖的FT-IR谱线。与a相比，b在3000cm－1 3600cm－1附近的吸收峰出现红移，1640cm－1和1560cm－1处出现的新峰为咪唑杂环上C=C和C=N的振动吸收峰［5］，同时在1069cm－1和1033cm－1也出现2个新峰，分别为组氨酸咪唑基团上的N－H和C－H伸缩振动峰。并且壳聚糖的－NH
2
伸缩振动峰（1650cm－1）在改性后消失，由FT-IR图说明产物为组氨酸接枝壳聚糖，并且反应发生在壳聚糖的C2－NH2上
。
Fig．2FT-IR Spectra of CS（a）and NHCS-0．5（b）2．1．2N-组氨酸壳聚糖的1H-NMR分析：采用20%氘代三氟乙酸-氘水（TFA/D2O）混合溶液作溶剂，测得NHCS-0．5的1H-NMR如Fig．3所示。与壳聚糖相比，NHCS在化学位移δ7．70和δ6．40处出现2个新的质子峰，分别为咪唑杂环上Ha和Hb质子的特征峰［6］；δ3．98处为组氨酸链接氨基和酰基的次甲基的Hd。组氨酸基团的Hc质子
法律人才峰约在δ3．0处出现，与壳聚糖的H3、H4、H5、H6和H6'的质子峰重叠在一起。由1H-NMR进一步说明产物为组氨酸接枝壳聚糖
。
Fig．31H-NMR Spectrum of NHCS-0．5in TFA/D2O
2．2N-组氨酸壳聚糖的元素分析
产物烘至恒量后进行元素分析测定。由C/N比计算产物的取代度［7］可知，NHCS-0．5、NHCS-1、NHCS-2、NHCS-3、50KD-NHCS-2及100KD-NHCS-2的DS依次为3．88%、6．97%、8．95%、10．78%、9．93%、9．46%，与文献综述的取代度［8］相近。随着组氨酸的比例增加，N-组氨酸壳聚糖的取代度也随之增大，这与1H-NMR的表征结果一致。此外，壳聚糖的相对分子质量也会影响组氨酸壳聚糖的取代度，当组氨酸/壳聚糖
合理情绪疗法351
第9期陈彰旭等：组氨酸改性壳聚糖多孔支架的制备与表征
的物质的量比为2ʒ1时，壳聚糖的相对分子质量越大，壳聚糖单元分子本身缠结的几率增大，空间位阻随之增大，导致产物的取代度有所降低
。
Fig．4X-Ray Diffraction Patterns of CS （a ），NHCS-0．5（b ），NHCS-1（c ），NHCS-2（d ）and NHCS-3（e
）
Fig．5TGA Curves of Chitsoan CS （a ），NHCS-0．5（b ），NHCS-1（c ），NHCS-2（d ）and NHCS-3（e ）
2．3
N-组氨酸壳聚糖的WAXD 分析
产物的X 射线衍射分析结果见Fig.4。扫描范围
3ʎ 40ʎ，扫描速率
4ʎ/min ，CuK α
辐射
（λ=0．154nm ），管压40kV ，管流30mA 。由图中a 可以看出，壳聚糖在2θ为10ʎ和20ʎ左右分别出现了强而宽的衍射峰。随着组氨酸接枝壳聚糖取代度的增加，产物在2θ为10ʎ和20ʎ附近的结晶峰逐渐消失。这是因为壳聚糖接枝组氨酸后，组氨酸单元的咪唑杂环和亚甲基的屏蔽作用使壳聚糖本身的氢键作用削弱，降低其有序程度，使产物的结晶性能减小，并且随着组氨酸取代度的增加结晶度降低。2．4
N-组氨酸壳聚糖的TGA 分析
称取5mg 10mg 样品，N 2保护下，在30ħ 800ħ范围以10ʎ/min 的速率升温，进行热重分析，结果见Fig.5。可见壳聚糖及其NHCS 衍生物有2个失重阶段，
第1个失重阶段在72ħ左右，这部分失重主要是壳聚糖的结晶水和自由水的散失所引起。与壳聚糖相比，其衍生物在这一阶段的失重更大，这可能是组氨酸
基团的引入增加了壳聚糖的亲水性。第2阶段的失重温度分别为294ħ、
276ħ、265ħ、249ħ和237ħ，这一阶段的失重是大分子链的降解及侧基的裂解所致。随着组氨酸取代度的增加，
失重温度降低、失重速率加快，这可能是组氨酸基团的引入破坏了壳聚糖的结晶性，
使热分解温度降低。热重分析表明，组氨酸基团的引入降低了壳聚糖的热稳定性，
并且随着组氨酸取代度的增加，产物的热稳定性降低，但在200ħ以下都有较好的热稳定性。2．5
N-组氨酸壳聚糖支架的SEM 分析
组氨酸接枝壳聚糖支架在液氮中脆断后，喷金，用
SEM 观察其微观结构，结果见Fig.6。由Fig．6（a ）可以看出NHCS-0．5支架呈多孔泡沫状，孔尺寸在5μm 12μm 之间，孔结构不均匀，孔数量比较少，其孔隙贯穿性不太理想。Fig．6（b ）中NHCS-1多孔支架的整体呈海绵纤维状，
孔尺寸在20μm 50μm 之间，孔结构均匀性较差，但孔数量较多，孔隙贯穿性较理想，该支
架的孔内部和孔间分布有纤维状细丝，
能够更好地诱导细胞向支架内和支架上移动和生长。Fig．6（c ）和
Fig．6（d ）中NHCS-2和NHCS-3支架均呈多孔海绵状结构，NHCS-2孔结构分布比较均匀，分散性好，平均在
100μm 左右，孔数量较多，出现三维多层孔洞结构，深层孔洞互相连通结构明显，孔间贯通性良好，孔隙率可
能比较大。NHCS-3孔径分布在100μm 120μm 的范围内，孔间贯通性较好，但深层孔洞互相连通结构变得
不明显。由上述支架材料的孔径可知，
NHCS-0．5可满足成纤维细胞需要，
NHCS-1、NHCS-2和NHCS-3可用于皮肤组织重建和骨组织工程。SEM 分析表明，组氨酸接枝壳聚糖取代度增加，支架孔径增大，而4种多孔支
架中NHCS-2孔径最均匀，深层孔洞互相连通结构最明显，可作为一种良好的生物矿化基质。
2．6N-组氨酸壳聚糖支架的孔隙率
按照实验部分1．3节的操作测定组氨酸接枝壳聚
糖支架的孔隙率和密度，
NHCS-0．5、NHCS-1、NHCS-2、NHCS-3孔隙率依次为85．16%、90．28%、93．34%、92．55%，密度依次为1．55ˑ10－2
g /cm 3、1．19ˑ10－2g /cm 3、1．11ˑ10－2g /cm 3、1．06ˑ10－2g /cm 3。随着组氨酸取代度的增大，孔隙率增加，支架的密度却减小，后面3种支架的孔隙率均大于90%，可以满足作为多孔支架对孔隙率的要求。高孔隙率也为生物矿化提供优良的模板［9］
幸福契约
，其中NHCS-2的孔隙率最大，孔径最均
匀，可望作为仿生调控生物矿物质的优良模板。
451高分子材料科学与工程2013年
Fig．6SEM Morphologies of NHCS-0．5（a ），NHCS-1（b ），NHCS-2（c ）and NHCS-3（d
）
Fig．7Influence of pH Value on Zeta-Potential of NHCS
2．7
N-组氨酸壳聚糖的Zeta 电位
分别取0．01g 样品于5%的醋酸溶液中，用氨水
和醋酸调节pH ，
激光动态光散射仪测定N-组氨酸接枝壳聚糖的Zeta 电位，结果如Fig.7所示。可见，pH 在6.5以下，N-组氨酸壳聚糖带正电荷，并且随着pH
增大，
Zeta 电位由+13．5mV 降低到+0．81mV ；pH ≥7．0，N-组氨酸壳聚糖带负电荷，随着pH 增大，Zeta 电位几乎呈现线性递减；当pH 从7.0增加到10.5时，Zeta 电位由－10．7mV 降低到－22．7mV 。由图中Zeta 电位等于0可推知N-组氨酸壳聚糖的等
电点在6.54左右，这与前人［10］
研究计算模式相吻合，因为壳聚糖的pK =6．50，而组氨酸的pK =7．59，因此
可以推断组氨酸接枝壳聚糖的等电点在6．50 7.59之间，当组氨酸的取代度较低时，等电点靠近6.50。N-组氨酸壳聚糖在不同pH 体系下所带电荷的电负性和荷电数不同，可实现其pH 响应性。3
结论
通过改变组氨酸/壳聚糖的配比和壳聚糖的相对分子质量可制备不同取代度的N-组氨酸壳聚糖泡沫状、海绵状等多种多孔支架。壳聚糖相对分子质量的减小和组氨酸投加量增多，均可使取代度增大，支架的孔径增大，密度反而减小。NHCS 支架孔间贯通性良好，孔尺寸分布在5μm 120μm 之间，支架孔隙率大于85%。不同的孔径分布和孔隙率可以满足成纤维细胞、皮肤组织重建和骨组织工程的需要，也可以为生
物矿化提供良好的模板。N-组氨酸壳聚糖的Zeta 电
位显示其具有pH 响应性。该支架的基因转染效率、药物释放、组织工程和生物矿化的应用有待后续研究。
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5
51第9期陈彰旭等：组氨酸改性壳聚糖多孔支架的制备与表征
651高分子材料科学与工程2013年
Preparation and Characterization of Histidine Grafted Chitosan Porous Scaffolds
Zhangxu Chen1，2，Meihua Xin1，Mingchun Li1
（1．College of Material Science and Engineering，Huaqiao University，Engineering Research Center
of Environment-Friendly Functional Materials，Ministry of Education，Xiamen361021，China；
2．College of Environment and Bioengineering，Putian University，Putian351100，China）
ABSTRACT：Using1-（3-dimethylamino propyl）-3-ethyl carbodiimide as initiator and N-hydroxysu
ccinimide as the cou-pler，the histidine was grafted onto chitosan（CS）．A series of histidine modified chitosan（NHCS）with different substi-tution degrees were prepared by changing the histidine amount and molecular weight of CS．Chemical structure and mor-phology of NHCS were characterized through Fourier transform infrared spectrometer，1H-NMR spectroscopy，elemental analysis，thermal gravimetric analyzer and scanning electron microscope．The results indicate that the degree of substitu-tion increases with the histidine dosage increasing，the pore size of NHCS scaffold increases，the pore size distribution is between5μm 120μm，the porosity is over85%，which can be applied in the fibroblasts，skin tissue reconstruction and bone tissue engineering．Zeta value of NHCS decreases from+13．5mV to－22．7mV with increase of pH value，which indicates that NHCS shows pH responsibility．Moreover，the pore size of the porous scaffold is comparatively uni-form with the molar ratio of histidine to CS0.5，which can provide a good template for biomineralization．
Keywords：histidine；chitosan；porous scaffold
（上接第151页。continued from p．151）
Preparation and Properties of Modified Rapeseed Oil/Organic
Montmorillonite Nanocomposites
Bin Lv1，2，Jianzhong Ma1，2，Dangge Gao1，Jianjing Gao1，Yingjun Zhang1
（1．College of Resource＆Environment，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an710021，
人物画报China；2．Key Laboratory of Auxiliary Chemistry and Technology for Chemical Industry，Ministry of
Education，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an710021，China）
ABSTRACT：Modified rapeseed oil（KRF）was synthesized using rapeseed oil，ethylene diamine and acrylic acid，then modified rapeseed oil/organic montmorillonite（KRF/OMMT）nanocomposites were prepared．The FT-IR results show that KRF/OMMT composites were successfully synthesized．XRD results demonstrate that KRF intercalates into the in-terlayer of montmorillonite．TGA result shows that the initial thermal decomposition temperature of leather fatliquored by KRF/OMMT nanocomposite increases to257ħ．KRF/OMMT composites were applied in fatliquoring process．The flame retardant properties results of leather indicate that flame-combustion time of leather fatliquored by KRF/OMMT nanocomposite decreases from146s to74s，s
moldering time decreases from958s to11s，and minimum oxygen consump-tion increases from14．8%to21%．The flame retardant properties of leather are significantly improved comparing with those of leather fatliquored by KRF．
Keywords：modified rapeseed oil；organic montmorillonite；nanocomposites；flame retardant property
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