周步光;刘月鸣;王平;王强;范雪荣
【摘 要】为提高丝素表面接枝共聚乙烯基单体的效率从而通过酶法制备丝素蛋白基吸水复合材料,首先借助EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)交联体系进行丙烯酸(AA)与丝素蛋白(SF)的接枝,通过丙烯酸上的羧基与丝素蛋白上的氨基反应使丝素蛋白上引入双键,提高丝素蛋白表面的接枝聚合反应位点.之后再进行辣根过氧化物酶(HRP)体系催化丝素蛋白与丙烯酸、丙烯酰胺(AM)以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)的共聚反应,最终生成再生丝素吸水复合材料.通过多种方法测定丝素溶液中游离氨基含量的变化、接枝前后溶液中丙烯酸含量的变化,分析不同条件下制得的丝素膜材料的形态,评价复合材料的吸水、保水、重复吸水和缓释性能.实验结果表明,丝素蛋白能通过EDC/NHS接枝引入丙烯酸单体;丙烯酸接枝后的和未接枝的丝素蛋白与丙烯酸和丙烯酰胺共聚制得的吸水复合材料相比,具有更好的吸水、保水性和重复吸水性能,较快的包载能力和较好的热稳定性能. 【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2018(035)004
【总页数】5页(P11-15)
【关键词】丝素蛋白(SF);丙烯酸(AA);EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺);辣根过氧化物酶(HRP);吸水材料
【作 者】周步光;刘月鸣;王平;王强;范雪荣
【作者单位】江南大学 生态纺织教育部重点实验室,无锡214122;江南大学 生态纺织教育部重点实验室,无锡214122;江南大学 生态纺织教育部重点实验室,无锡214122;江南大学 生态纺织教育部重点实验室,无锡214122;江南大学 生态纺织教育部重点实验室,无锡214122
锦屏泥石流【正文语种】中 文
【中图分类】R318.08;TS195.5
高吸水性树脂是一种含有强亲水基团，交联网状的功能高分子材料，具有很强的吸水和保水能力，在环境治理、土木建筑、抗旱保水等领域得到了广泛的应用[1-4]。传统的高吸水材料如丙烯酸盐类树脂存在难生物降解、易造成环境污染等问题，目前研究开发生物降解
性能的吸水材料已成为趋势。其中利用高分子吸水树脂和天然大分子物质进行共聚反应，制备可降解的高吸水树脂是当前的研究热点[5-7]。
丝素蛋白(SF)是蚕丝的主要组成部分，具有良好的生物相容性和可降解性，含有约10%的酪氨酸酚羟基和大量酰胺键邻位的α-H，有较高的反应性，可以通过化学法(过硫酸铵或过硫酸钾氧化还原引发剂)或紫外法(光引发剂)与外源功能化合物进行接枝共聚，构建丝素基功能复合材料[8-9]。相比而言，生物酶催化接枝共聚条件温和，具有特异性和选择性，能减轻环境污染，所以本研究主要侧重于用氧化还原酶体系引发SF与乙烯基单体的接枝共聚合。实验以SF为原料，借助于EDC/NHS接枝AA引入双键，促进SF与AA和AM分子的辣根过氧化物酶(HRP)体系催化接枝聚合效果，探究接枝AA对制备丝素基吸水材料性能的影响(文中所有缩写见附表)。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
蚕丝练白绸(35.5 g/m2，江苏鑫缘茧丝绸有限公司)；辣根过氧化物酶(HRP酶活>300 U/mg，
上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙烯酰胺(AM)、丙烯酸(AA)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、乙酰丙酮(ACAC)、无水氯化钙(CaCl2)、乙醇(CH3CH2OH)、吗啉乙磺酸(MES)等分析纯试剂，均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 丝素溶液制备
以物质的量比n(CaCl2)∶n(CH3CH2OH)∶n(H2O)=1∶2∶8溶液溶解真丝绸[10]，在75℃水浴条件下搅拌3 h使蚕丝充分溶解得到丝素溶液，装入透析分子质量为8000～14 000 u的透析袋中用去离子水对丝素溶解液进行透析，直至透析液电导率值小于4 μs/cm，再将丝素溶液离心(10 000 r/min，5 min)去除不溶物，以称重法标定丝素蛋白溶液的浓度，将丝素溶液保存在4℃冰箱中备用。
1.2.2 丙烯酸接枝丝素反应
取丝素蛋白和丙烯酸的物质的量比为n(SF)∶n(AA)=1∶1，EDC的用量为SF和AA总量的20%，
且n(EDC)∶n(NHS)=2∶1。先使用NaOH调节MES缓冲液的pH为5.5，然后将一定量的AA、EDC和NHS加入MES缓冲溶液中活化30 min，再加入5 g/L SF溶液反应4 h，反应结束后将反应液透析48 h除去未反应的AA后进行溶液性能测试。不同对照样品有纯SF溶液、SF(EDC/NHS)。
1.2.3 HRP催化SF-g-AA/AA/AM复合吸水材料制备
设定乙烯类单体反应物质的量比为n(AA)∶n(AM)∶n(MBA)=2∶1∶0.05，加入含有接枝后的丝素蛋白的缓冲溶液中(含AA样品用NaOH将溶液中和至pH 7.0)，再加入300 μL ACAC和1 mL(1 mg/mL HRP)酶溶液，放入三口烧瓶中通氮气30 min，逐滴加入100 μL 30% H2O2，加样结束后继续反应4 h。不同对照样品有SF/AA/AM/MBA、AA/AM/MBA，反应后放入聚四氟乙烯模具内在-18℃冰箱中冰冻4 h，随后放入-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24 h完成膜材料的制备。
1.3 分析测试方法
1.3.1 游离氨基测试
田晓菲
1)茚三酮测试法。取1 mL丝素反应液和2 mL茚三铜溶液加入10 mL 离心管中，沸水煮20 min后冷却15 min，再加入5 mL含0.2%(W/V)KIO3的乙醇稀释液中，混匀后用LV-1800测定569 nm的吸光度。(茚三酮溶液的配制方法：0.06 g/mL KH2PO4、0.1 g/mL Na2HPO4、3 g/L果糖、5 g/L茚三酮，加去离子水溶解)。
以甘氨酸做出标准曲线计算游离氨基的浓度：
Am=1.7697Cm-0.0013
(1)
式(1)中：Am是569 nm可见光条件下溶液的吸光度；Cm为谷氨酸浓度(μmol/mL)。
共享2) OPA测试法。取200 μL丝素反应液和4 mL OPA混匀后在室温条件下反应2 min，然后测定混合液在340 nm处的吸光度值；空白样是在OPA试剂中加入200 μL水。OPA试剂的配制方法：准确称取40 mg/mL邻苯二甲醛/甲醇溶液，然后分别依次加入20%(W/V)的SDS溶液，0.1 mol/L硼砂溶液以及2 μL/mL β-巯基乙醇，需即配即用。
以L-亮氨酸做出标准曲线计算游离氨基的浓度：
An=0.3488Cn-0.0561
(2)
式(2)中：An是340 nm紫外光条件下溶液的吸光度；Cn为L-亮氨酸浓度(μmol/mL)。
1.3.2 双键滴定法
实验采用溴酸钾-溴化钾化学滴定法来测定溶液中双键的含量[11]。在SF和AA经EDC/NHS交联体系反应后的溶液中加入双倍体积乙醇析出丝素蛋白，离心(4000 r/min，5 min)。取10 mL上层清液置于250 mL碘量瓶中，加入2 mL丙酮，20 mL溴标准溶液以及5 mL盐酸溶液充分混匀，置于4℃冰箱中冷藏30 min，取出后再加入15 mL碘化钾溶液再次冷藏5 min，加入100 mL去离子水，立即用Na2S2O3标准溶液对其进行滴定，滴定至溶液呈淡黄，再加入3 mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝消失即为滴定终点，记下最终使用Na2S2O3溶液的体积，以此来计算溶液中双键的含量。
溴滴定法滴定3组样品：样品1为1.25 g/L丙烯酸稀释液，相当于SF与AA交联反应前的溶液；样品2为在EDC/NHS交联体系作用下AA和SF反应后的溶液经乙醇析出沉淀后取得的
上清液；样品3为去离子水，作为空白样。计算公式为：
×20我国的资源状况
(3)
式(3)中，N1为交联反应后溶液中剩余AA的物质的量(mol)；C为Na2S2O3溶液的浓度(mol/L)；V3为在滴定样品3时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)；V2为在滴定样品2时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)。
×20
(4)
式(4)中，N2为交联反应中参与反应的AA的物质的量(mol)；C为Na2S2O3溶液的浓度(mol/L)；V2为在滴定样品2时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)；V1为在滴定样品1时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)。
1.3.3 吸水性能测试
国家公路网规划发布
对得到的AA/AM/MBA(a)，SF/AA/AM/MBA(b)，和SF-g-AA/AA/AM/MBA(c)这3组吸水材料进行吸水倍率测试[12]。首先称取一定量的吸水材料样品，在水中浸渍不同的时间，后用滤纸吸干表面多余水分，再次称重，根据公式(5)计算材料的吸水倍率Q：
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