黄忠发;张淑真;蓝正文;吴坤烈;陈淑颖;林意文;郭士民
【摘 要】利用凝集素分子对醣类有专一性吸附特性,对内毒素结构中的多醣类成分进行吸附,建立了凝集素去除胶原蛋白溶液中内毒素的吸附系统.二氧化硅玻璃经酸蚀,再以胺基硅烷进行胺化后,将凝集素嫁接其上.结果表明,1,2和5 g/L的凝集素对于胶原蛋白溶液中内毒素吸附率皆大于99％；30颗嫁接凝集素玻璃球可去除8.4 mL胶原蛋白溶液(浓度为2g/L)中内毒素(去除率大于99％).未来更可将嫁接凝集素玻璃球填充于管柱内部,利用管柱分离法去除胶原蛋白溶液中内毒素,建立有效、操作简单且成本低廉去胶原蛋白溶液内毒素装置. 荷电
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2013(041)010
【总页数】5页(P1482-1486)
【关键词】胶原蛋白;内毒素;凝集素;二氧化硅玻璃球
【作 者】黄忠发;张淑真;蓝正文;吴坤烈;陈淑颖;林意文;郭士民
【作者单位】上海市嘉定区中医医院,上海201800;义守大学生物医学工程系,高雄82445;义守大学生物医学工程系,高雄82445;义守大学生物医学工程系,高雄82445;义守大学生物医学工程系,高雄82445;义守大学生物医学工程系,高雄82445;义守大学生物医学工程系,高雄82445
【正文语种】中 文
随着组织工程技术的迅速发展,许多组织修复生物性取代材料纷纷问世,并已成功应用于皮肤、外围神经、牙周组织及齿槽骨等组织再生领域。其中,胶原蛋白是众多取代材料中应用最为广泛,且最具潜力的生物材料。胶原蛋白应用范围涵盖保健营养品、化妆品和高阶医药等众多产业,利用其生物兼容性、具生物可降解性、抗菌性与止血性等优点,经适当后续处理后,可控制其在体内分解速率并可加工成不同的应用型态[1]。此外,胶原蛋白还可依据临床应用的需求,制成薄膜、海绵状、粉末或纤维织品等多种形态,作为止血、整型外科及烧烫伤敷料等临床应用。然而,市面上贩卖的胶原蛋白多受到内毒素存在的困扰,许多以胶原蛋白为原料的医用产品,常会因为其内毒素含量过高,造成材料与生物体接触或植入后产生严重免疫
反应而限制其应用。因此,寻求有效去除内毒素方法,对于发展胶原蛋白材料在医用产品方面的应用极其重要。
广丰县教育局内毒素为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一部份,革兰氏阴性菌的细胞膜内层为磷酯层,内毒素则是存在于外膜。内毒素为具有疏水性脂多醣体(Lipopolysaccharide,LPS)的小分子,分子量约为10 kDa。生物体毒性反应主要来自脂质部分(Lipid A)。当内毒素(脂多醣体分子)进入动物体血液或身体组织中时,脂多醣体会启动体内的各种免疫反应,产生发烧、白血球数目改变、弥漫性血管内凝血反应、低血压、休克,甚至死亡等非特异性的生理病理反应。即使少量的内毒素也会导致大多数的哺乳动物死亡[2,3]。
内毒素为高度热稳定性分子,煮沸30 min仍无法破坏其稳定性,超氧化物、过氧化物和次氯酸盐(漂白水)等强氧化剂可将其分解。由于内毒素具高度热稳定性,同时亦具有良好的化学稳定性,因此须使用强氧化剂才可将其分解;然而胶原蛋白不论是在高温处理或是强氧化剂的反应后,皆会产生变性现象,因此胶原蛋白并不适用此类方法去除所含内毒素。目前,去除胶原蛋白中内毒素的方法为:在胶原蛋白萃取纯化过程中采取全程无菌操作及严密的无菌控管,以制备出无内毒素的胶原蛋白;另可在胶原蛋白萃取后以不同分子量过滤膜过滤内毒素与胶原
蛋白;或以离子交换法去除胶原蛋白中的内毒素[4～6]。上述方法均能将内毒素从胶原蛋白溶液中移除,但实验成本相当高,使得低/无内毒素的胶原蛋白价格居高不下,限制胶原蛋白的发展及应用。此外,有研究利用脂多醣体分子中的Lipid A基团,以脂质吸附进行包覆以形成微胞,进而将内毒素移除[7,8],但此分离方法不适用于去除内毒素胶原蛋白材料的大量生产。
本研究利用凝集素分子对于醣类分子专一吸附特性,对内毒素结构中的多醣类成分进行吸附,以除去胶原蛋白溶液中所含内毒素。凝集素是一种对醣类具有高度特异性的醣类接合蛋白[9,10]。在免疫技术中常利用凝集素辨识细胞膜上特定醣蛋白结构。凝集素具有多价结合能力,能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合,因此常作为研究细胞膜上特定醣基的探针,或是应用于分离纯化具有重要生物功能的醣类。不同凝集素对特定醣基具有专一性的结合能力,如小麦凝集素对N-乙酰葡萄糖胺有特异性结合能力,在内毒素脂多醣体分子中含有N-乙酰葡萄胺,因此或可利用凝集素进行N-乙酰葡萄胺吸附以除去内毒素。本研究最终目标是以凝集素去除胶原蛋白溶液中内毒素,并进一步将嫁接凝集素玻璃球填充于管柱内部,利用管柱分离法去除胶原蛋白溶液中内毒素,建立有效、操作简单且成本低廉去胶原蛋白溶液内毒素装置,从而大幅降低低/无内毒素胶原蛋白制造成本,提升胶原蛋白产品整体应用的成效。
2.1 胶原蛋白萃取与纯化
于4℃,将牛皮除毛,以0.02 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗干净,将牛皮剪成约0.5 cm×0.5 cm的碎片;以0.15 mol/LNaCl、50mmol/L Tris缓冲液(pH 7.4)清洗后,将其置入0.5 mol/L醋酸溶液中,以均质搅拌机打碎,使胶原蛋白从牛皮组织中溶解出来;加入0.5 g/L胃蛋白酶作用16～24 h后,高速离心溶有胶原蛋白的醋酸溶液,收集上清液;加入2.5 mol/L NaCl于上清液中进行盐析,待静置16～24 h后,再进行高速离心,收集沉淀胶原蛋白;将胶原蛋白沉淀物以50 mmol/L Tris缓冲液透析,去除盐分,将其溶于含1 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris缓冲液中,静置16～24 h后进行高速离心,收集上清液;加入1.8 mol/L NaCl于上清溶液中,以均质机搅拌均匀后静置16～24 h,高速离心后收集上清液;纯化后胶原蛋白醋酸溶液中于-20℃低温下保存,待使用时以pH 7.2磷酸盐缓冲溶液于4℃下透析至中性。索爱w958C
2.2 玻璃球凝集素吸附剂设计与制备
采用小麦凝集素作为去除内毒素吸附剂,先以H2SO4-H2O2(3∶1,V/V)蚀刻玻璃球(直径0.5 cm) 4 h,先使玻璃球表面产生氢氧基,接着加入以胺基硅烷(98%)反应1 h进行胺化,以0.25%1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbo
dimide,EDC)及0.06% N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)反应30 min,再以无热原水配制不同浓度(1,2及5 g/L)凝集素,与活化后玻璃球反应4 h。以表面元素分析仪(Electron spectroscopy for chemical analysis,ESCA)分析所得玻璃球反应前后的元素变化,以确认玻璃球是否嫁接上凝集素。
2.3 内毒素移除分析
内毒素移除测试分析先采用类似内毒素结构多醣体醣蛋白作为测试样品。内毒素含量检测则使用内毒素含量检测试剂CAPE COD,(Kit no:XP0202,USA)。内毒素浓度测定采用LAL(Limulus amebocyte lysate)凝胶终点呈法。LAL试剂与内毒素反应形成黄的凝胶,于酶联免疫吸附分析仪(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA reader)波长405 nm下测得吸光值,再与标准溶液所测吸光值比较后,即可测得内毒素含量浓度。在不同的凝集素浓度、胶原蛋白溶液及温度条件下,测试玻璃球凝集素吸附剂移除内毒素效能。
3.1 胶原蛋白萃取纯化
第一型胶原蛋白的分子量约为283 kDa,由两条含有1056个胺基酸的α1,以及一条含有1029中山大学 bbs
个胺基酸的α2组合而成。SDS-PAGE电泳实验(图1)表明,本研究萃取纯化的胶原蛋白产物具有较高的纯度。
3.2 玻璃球凝集素吸附剂表面元素分析
图2为玻璃球嫁接凝集素反应示意图。此反应过程简易且可大量制备玻璃球凝集素吸附剂。
图3为玻璃球改质后表面元素分析结果。图3A及3B为未经处理玻璃球及经酸蚀后玻璃球表面分析结果,经酸蚀后玻璃球表面氧原子由37.5%增至53.2%,显示玻璃球表面已产生氢氧基。图3C所示为玻璃球表面经胺基硅烷胺化后结果,其中氮原子的增加显示玻璃球表面已胺化而产生胺基。再经EDC/ NHS交联作用将凝集素嫁接在此胺化后玻璃球表面,氮原子由8.4%增加至10.1%。氮原子含量增加表明凝集素已嫁接至胺化后玻璃球表面(图3D)。
3.3 凝集素浓度对内毒素吸附的影响
以玻璃板为进行测试(表1),利用不同浓度凝集素(1,2和5g/L)与胺化后玻璃板表面反应,所制成玻璃板凝集素吸附剂均能有效吸附胶原蛋白溶液(浓度为0.5g/L)内所含内毒素,内毒素含量由2.14×105EU降低至10-2～10-3EU间,其内毒素吸附率可达99%。考虑制造成本,在后续中小企业人力资源管理
的凝集素嫁接改质上均采用浓度为1 g/L凝集素进行制备。
3.4 玻璃球凝集素吸附剂吸附内毒素测试
为测试玻璃球凝集素吸附剂吸附内毒素效率,利用2 g/L胶原蛋白溶液进行不同玻璃球颗数(提供不同吸附表面积)及不同体积胶原蛋白溶液内毒素吸附测试(表2)。结果表明,未经吸附处理胶原蛋白溶液内所含内毒素浓度为2.34×108EU,当玻璃球数目固定在30颗玻璃球时,嫁接在其上的凝集素能吸附8.4 mL胶原蛋白溶液中内毒素,其内毒素可降低至2.80×10-3EU。但当胶原蛋白溶液体积再增加时,其内毒素吸附效果却急剧下降,表明所嫁接凝集素均已吸附上内毒素。当胶原蛋白溶液体积固定在6 mL时,可发现70颗玻璃球吸附后,内毒素浓度为3.06×10-5EU,因其可提供较多大的接触面积,所以吸附效果提升。
由于不同浓度胶原蛋白溶液其内毒素含量均会不同,且胶原蛋白溶液黏度亦随浓度增加而增加,此黏度的增加会影响胶原蛋白溶液内内毒素与凝集素接触的机会而降低吸附效率。对1 mL的5和6 g/L胶原蛋白溶液进行内毒素吸附前后比较(表3)。嫁接上凝集素玻璃球虽能降低浓度6 g/L胶原蛋白溶液内毒素含量,由3.01×109EU减少至2.39×105EU,但其内毒素含量很高,显示在高浓度胶原蛋白溶液内毒素去除上仍有限制。
通常,胶原蛋白在萃取纯化过程中均需于4℃的低温环境下进行,若环境温度超过4℃时,所萃取纯化后胶原蛋白便会开始重组产生纤维的型态。本研究在不同环境温度下测试了凝集素吸附内毒素效率。在此实验中是以类似内毒素成份多醣体的醣蛋白作为测试样品,凝集素在室温25℃及4℃的低温环境下也具有极佳内毒素吸附效果,显示凝集素内毒素吸附效果较不受温度的影响。
胶原蛋白的纯化及保存不易,限制了胶原蛋白于临床上的应用。在胶原蛋白萃取并纯化过程及内毒素含量测定后,进一步研究出简单、方便、易操作的去除内毒素方法,以有效缩短低内毒素胶原蛋白产品的成本,期望能发展出低内毒素的胶原蛋白材料。
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