聂丽菊;许恒毅;叶称连;黄小林;刘雯婷;傅芬
【摘 要】目的：研制一种生物素-亲和素系统（BAS）介导叶酸受体（FR）靶向量子点（QD）荧光探针，初步验证其靶向性及信号放大效应。方法：采用活泼酯法，将链霉亲和素（SA）与QD共价偶联制备QD-SA并对其物理特性进行验证；采用活泼酯法以牛血清蛋白为载体合成生物素化叶酸（FA）。通过生物素化FA与QD-SA结合制备BAS介导叶酸受体（FR）靶向QD探针，比较该探针对卵巢癌SKOV3细胞及FR表达阴性的肺癌A549细胞的识别情况，并验证其靶向特异性；对比该探针在生物素化FA孵育1、4 h时成像的效果；比较该探针与未经BAS介导的QD-FA探针在不同孵育时间对卵巢癌SKOV3细胞成像的差异。结果：BAS介导FR靶向QD探针可特异性识别FR表达阳性的卵巢癌SKOV3细胞，且孵育4 h较1 h荧光信号明显增强，同等条件下其产生的荧光强度较未经BAS介导的QD-FA探针明显增强。结论：制备了一种特异性好、灵敏度高的BAS介导FR靶向QD探针，该探针在卵巢癌早期诊断方面具有潜在应用价值。%Objective:To develop a biotin-streptavidin system (BAS)-mediated folate receptor (FR)-targeted quantum dot (QD) fluorescent prob e and preliminarily validate the targeting ability and signal amplification effect of the probe. Methods: Streptavidin (SA) was covalently coupled with QD through the active ester method;the physical characteristics of the prepared QD-SA were veri-fied. Biotinylated folate was synthesized through the carrier bovine serum albumin using the same method and then reacted with QD-SA to form the special probe. The probe was used to identify SKOV3 cells and FR-negative A549 cells to verify its targeting speci-ficity. QD-SA was used as the contrast. SKOV3 cells were imaged using the BAS-mediated FR-targeted QD probe with a biotinylated folate incubation time of 1 or 4 h. Various reaction times were also tested between the probe and the QD-FA that was formed without BAS mediation. Results:The BAS-mediated FR-targeted QD probe specifically recognized FR-positive SKOV3 cells. The probe ob-tained higher fluorescent intensity after 4 h than after 1 h of biotinylated folate incubation. The BAS-mediated FR-targeted QD probe al-so had a stronger fluorescent signal than the QD-FA probe. Conclusion:The proposed probe presents a great potential in the early diag-nosis of ovarian cancer because of its high specificity and sensitivity.
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【期刊名称】《中国肿瘤临床》
【年(卷),期】2014(000)019
批林批孔【总页数】5页(P1254-1258)
【关键词】生物素-链霉亲和素;叶酸;量子点;卵巢癌细胞;体外成像
【作 者】聂丽菊;许恒毅;叶称连;黄小林;刘雯婷;傅芬
【作者单位】江西省南昌大学第二附属医院妇产科 南昌市330006; 江西省南昌大学食品科学与技术国家重点实验室;江西省南昌大学食品科学与技术国家重点实验室;江西省南昌大学第二附属医院妇产科 南昌市330006;江西省南昌大学食品科学与技术国家重点实验室;江西省南昌大学第二附属医院妇产科 南昌市330006;江西省南昌大学第二附属医院妇产科 南昌市330006
【正文语种】中 文
卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，虽其发病率位于女性生殖系统肿瘤中第3位，但病死率却居于
首位。大多数卵巢癌被确诊时已是晚期，其5年生存率仅为30%，研究表明早期发现卵巢癌可使其5年生存率增长至92%［1］。因此，早期诊断和卵巢癌是改善患者预后提高其生存率的重要因素［2］。目前临床上常规诊断卵巢癌方法为经阴道超声、磁共振成像、实验室肿瘤标记物和组织学检查等，这些方法通常难以满足临床对卵巢癌早期精确诊断的需求。研究表明癌症患者外周血中循环肿瘤细胞的出现早于可见的实体瘤［3］，因此，寻特异性靶向卵巢癌细胞的生物探针是目前研究的热点［4］。量子点（quantum dot，QD）是一种新型半导体纳米晶体，具有荧光量子效率高、光化学稳定性好以及不会发生光漂白作用等优点［5］，可结合抗体、多肽等制备高性能的荧光探针，靶向肿瘤细胞，实现肿瘤的早期诊断［6-7］。由于叶酸受体（folate receptor，FR）在卵巢癌细胞表面表达高为95%［8］，当叶酸（folic acid，FA）与QD偶联制成生物荧光探针后，可通过FA与FR的高亲和力（Kd为0.19 nM［9］）结合，将QD高效富集在肿瘤细胞表面，实现细胞的特异性靶向成像。然而，叶酸分子量小，直接连接到QD表面后，其分子结构及其结合活性基团可能被改变，影响其生物活性。因此，本研究使用生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS），介导QD与FA偶联制备BAS介导FR靶向QD探针。利用该探针同时检测卵巢癌SKOV3细胞及肺癌A549细胞，验证其靶向特异性，对比该探针与未经BAS介导的Q
D-FA探针在卵巢癌SKOV3细胞成像中的差异，以明确BAS的信号放大作用。本研究旨在建立一种快速、特异、高效靶向卵巢癌细胞成像方法，为卵巢癌早期诊断提供参考依据。
1.1 材料
羧基化水溶性QD购自美国Ocean NanoTech公司；QD-FA由本课题组前期合成；生物素氨己基-N-羟基丁二酰亚胺活性酯、链霉亲和素（streptavidin，SA）购自上海华蓝化学公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自韩国BIOSHARP公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自南京森贝伽生物科技有限公司；1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）购自美国Sigma-Aldrich公司，其他试剂为分析纯；卵巢癌SKOV3细胞由江西省南昌大学第一附属医院实验中心馈赠；12孔细胞培养板购自江苏海门博洋实验器材厂；直热式CO2培养箱购自美国Thermo scientific公司；倒置荧光显微镜为日本Nikon公司产品。
1.2 方法
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1.2.1 QD-SA的合成及其物理特性验证 采用活泼酯法将QD表面的羧基与SA的氨基共价结合形成QD-SA，其合成方法参照文献［10］进行。具体如下：取100 μL QDs（浓度为8 μM）溶于pH为5.5的100 μL的硼酸缓冲液（borate buffer，BB）中，按照QD∶EDC摩尔比1∶1 000，QD∶NHS摩尔比为1∶2 000分别加入EDC/NHS，室温反应5～10 min。调整溶液pH至8～8.5，加入SA 1.056 mg，持续混匀2 h后，加入10 μL含5% BSA的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）封闭10 min终止反应。QD-SA复合物10 000 r/min离心，离心5 min，除去沉淀，使用pH为7的2 mL BB在100 K超滤管中洗涤，最后重悬于pH为7的0.1 mL BB中并通过琼脂糖凝胶电泳验证其偶联效果。此外，采用动态光散射分析仪及透射电子显微镜对QD偶联前后物理性质进行分析，以了解其特性改变。
1.2.2 生物素化FA的合成 首先将FA与BSA结合，再与生物素结合制备生物素化FA。1）FA-PEG-NH2的偶联：FA 6 mg溶解于600 μL二甲基亚砜中，加入DCC 3 mg、NHS 3 mg及三乙胺60 μL共同暗室反应4 h，加入双氨基聚乙二醇30 mg暗室反应过夜；反应完全后离心，使用-20℃丙酮沉淀，乙酸乙酯洗涤3次，置于通风柜中干燥并避光保存。2）FA-PEG-BSA的偶联：FA-PEG-NH25 mg、EDC 2.5 mg、NHS 2.5 mg溶于pH为7的500 μL BB中，共同室温反应10 min；加入BSA 8.35 mg，室温反应2 h，透析纯化3次后于4℃冰箱保
存。3）生物素化FA的制备：长链生物素∶FA-PEG-BSA摩尔比为20∶1混合后室温孵育30 min，将混合溶液于4℃超纯水透析3 d，4℃保存备用。
1.2.3 BAS介导FR靶向QD在卵巢癌SKOV3细胞体外成像中的应用 取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞及肺癌A549细胞，接种于12孔板内，细胞约1×106/mL。37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h；吸弃所有孔内培养基，PBS洗涤1次后加入生物素化FA（对照组不加）分别孵育1、4 h；PBS洗涤后加入QD-SA（QD-SA∶生物素化FA为1∶20）共孵育30 min；PBS洗涤3次后加入适量DAPI核染料，室温反应20 min；使用PBS洗净并重悬，倒置荧光显微镜下观察细胞染结果。此外，将孵育的卵巢癌SKOV3细胞分为加入生物素化FA组、未加入组，共同孵育4 h，PBS洗净后分别加入QD-SA及QD-FA反应30、60 min，随后用PBS洗净，加入DAPI，其余操作同前，以验证BAS的信号放大效应。
2.1 BAS介导FR靶向QD探针捕获卵巢癌细胞的原理
BAS是一种新型生物标记技术，将SA修饰的QD与BSA介导合成的生物素化FA结合，可明显增加细胞表面FR结合FA的数目，使更多的QD靶向在细胞表面，增强荧光信号，提高检测灵敏度，从而实现快速、特异、高效靶向卵巢癌细胞成像（图1）。
局地战斗机2.2 QD-SA的物理特性验证
2.2.1 QD-SA的性质 本实验制备的QD-SA在常温下为澄清的红溶液。动态光散射分析（图2A）表明其水化粒径分布较集中，平均为（25.5±0.6）nm，Zeta电位为（-48.2±5.3）mv，透射电子显微镜显示（图2B）该粒子大小均一，平均为（9±0.5）nm。
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 电泳迁移率主要取决于分子大小、介质粘度及颗粒所带电荷。QD及QD-SA在凝胶电泳中均能由阴电极向阳电极泳动，但QD（左侧）的迁移率明显快于QD-SA（右侧）。这是由于在同等电泳条件下QD偶联SA后，形成的QD-SA粒径较QD增大，其表面负电荷也由于羧基与SA表面氨基的反应消耗而较QD表面负电荷少，因此在电场中QD-SA由阴电极向阳电极泳动的速度较QD更慢（图2C）。
2.3 BAS介导FR靶向QD捕获卵巢癌SKOV3细胞
2.3.1 BAS介导FR靶向QD捕获卵巢癌SKOV3细胞及肺癌A549细胞荧光强度对比 未经生物素化FA孵育及QD-SA反应的卵巢癌SKOV3细胞膜表面未见荧光（图3A），而经生物素化F
A孵育后的卵巢癌SKOV3细胞在加入QD-SA后，细胞膜表面均可见较强的荧光，其中孵育4 h时尤为明显（图3B、3C）。此外，只加有QD-SA反应的卵巢癌SKOV3细胞及经生物素化FA孵育4 h再加入QD-SA反应的肺癌A549细胞膜表面均未见明显荧光（图3D、3E）。表明BAS介导FR靶向QD可特异性识别FR表达阳性的卵巢癌SKOV3细胞，且随着FA与细胞孵育时间的延长，FA与细胞表面FR结合数量增加，进而产生的荧光信号也增强。
2.3.2 QD-FA与BAS介导FR靶向QD捕获卵巢癌SKOV3细胞的荧光强度对比 QD-FA与BAS介导FR靶向QD共同捕获细胞时，在相同的反应时间内，QD-FA所产生的荧光强度明显偏弱，而随着反应时间的延长，各细胞膜表面的荧光强度逐渐增强（图4）。
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