合物及其鉴定
第24卷第l0期
崔致远
2002年10月
第一二夫学
Al:TAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISIER兀AE
VO1.24.No.10
0(t.20021229
文编:10oo5404/2002)10—1229—02
萨奇尔氯胺.T氧化C5，体外组装补体膜攻击复合物及其鉴定
周镜然，朱锡华，白云，姜曼，黎万玲(第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所，重庆4ooo38)
论着
提要：目的利用氧化的方法在无酶解反应发生的情况下获得活化形式的C5，进而实现以纯化的补体终末成分体外组装补 体膜攻击复合物(MAC).方法以蛋氨酸氧化剂氯氨一T与纯化的(=5相互作用后，加入C6组装具溶血活性的C.56复合物.以此复 合物与NHS或纯化的后续终末补体成分组装MAC，检测复合物的溶血活性.结果反应性溶破实验证实，氯胺一T氧化(=5与C6绀
装形成功能C56复合物，后者可与NHS或纯化的补体终末成分(:7～
C9体~‟beH装具溶血活性的MAC，并且所形成的C.56复合物在24 h达到最大的溶血活性,48h仍保持稳定.结论氯胺一T在不裂解c5的条件下产生了CSb样活性分子，该分子能与C6组装形成稳
定的活性复合物，并可与其它补体终末成分组装产生活性MAC.
关键词：补体膜攻击复合物；补体终末成分；氯氨一T
中图法分类号:R392.1l;R392.12文献标识码:A AssemblingandidentificationofmembraneattackcomplexafterC5activatio ninvitro
.
ZHOUJing—ran.ZHUXi—hua.BAIY un,JIANGMan,LIWan—lin(De[1a rlrnenloflmmunolo~,ThirdMilitary.MedicalUniversity,Chongqing400038, ChhⅢ
Abstract:ObjectiveToformhemolyticamembraneattackcomplex(MAc)wi thpurifiedhumanterminalcomponentsofcomplementafteracti—
vatil)n0f(=5withchloramineT(C1一T),amethionineoxidizingagent.MethodsPurifiedhuman(=5wasincubatedwi thC1一Tinbarbitalbuffer.C6
Wasaddedt0fnrlTlastableC56complex10rainlater.AfterincubationwithN HSorpurifiedC7,C8andC9,MACformationandlysisofnon—sensi—tizedguineapigredcellsfreactivelysis)wereassayed.ResuRsC1一T-treatedC5acquiredabindingsitefbrC6toformC56;Afteritincubated withC6andSUbsequentadditionofNHSorC7.C8andC9.amembraneattack碳化硅粉
complexWasformedwhichlysednon—sensitizedguineapigredcells. ThehemoMicactivityWasinadose—dependentfashion.ConclusionC1一ToxidatingC5lcadstOformC5b-likefunctionalactivitymoleculeswhich canbindtoC6andformhemol,rticMAC.
Keywords:Men~raneattackcomplex;terminalcomponentofcomplement;c hloramineT
已经证实，亚溶破MAC的细胞非致死性效应在多
种疾病的发生，发展中起着重要的作用，因此MAC
的病理效应成为近年来补体领域研究中的一个热点.
在体外组装MAC并建立MAC细胞亚溶破模型是这类
研究的前提.但通过经典或替代途径活化正常人血清
得到MAC的过程中，有多种具有不同生物学活性的补
体活化产物如C3a,C5a等在体系中产生，严重干扰了
对MAC病理效应的观察与判断.因此，利用纯化的补
体终末成分的进行研究十分必要，其中如何活化补体
C5分子从而启动MAC的组装是问题的关键.有研究
显示，氧自由基或蛋氨酸氧化剂可在无酶解反应发生
的情况下获得活化形式的C5_4.因此，本研究利用氯
胺一T作为蛋氨酸氧化剂，探索了在不裂解C5的条件
下活化补体终末成分，组装MAC的条件，获得了真
亨利基金项目
作者简介
通信作者
收稿日期
家自然科学基金资助项日(39789010)；国家重点基础研究发展圳划资助项日(“973”项目)(G1999054.200)
倒镜然(1972一)，女，四川I省威远市人，博士，讲师，主要从事补体分q物学方面研究电话:(023)68752238
n,E.J】1aii:IHiy26@vahoo(.()111.ca
2001.1205；修回日期:2O02.01.18
正功能纯的活性MAC，为进一步深入研究MAC的病理
效应及其机制奠定了良好基础.
1材料与方法
1.1实验材料
纯化的补体终末成分(=5～C9(CalBioehem)；氯胺一T，蛋氨酸(Sigma).其余化学试剂均为分析纯.
1.2主要实验设备水利水电技术
3550型酶联检测仪(Bio-Rad).
1.3氯胺一T氧化法组装活性C56
参照文献[5]方法进行.10C5中加入l0VBS,10
0.32mmol/L氯氨一T(Chloramin-T)，混匀后室温反应10min.加人l0lmmol/L蛋氨酸终止反应后，加入20C6及200无
血清DMEM培养基，置37℃孵育，组装活性C56复合物.
1.4反应性溶破实验鉴定组装C56分子的溶血活性
保存于阿氏液中的豚鼠红细胞经VBS洗涤后，以l×l/
100铺板，加入不同剂量C56，混匀后37℃孵育l5min，加入
l:l0稀释NHS-EDTA,37℃孵育lh,l500g离心l0rnjn.小心
吸出上清，上清在波长415lifo处测吸光度，计算各孔溶血情况将能引起l×107的豚鼠红细胞发生溶破的C56量定义为1个溶血单位.
1230第■军医大学第24卷
1.5纯化的补体终未成分体外组装MAC及其对豚鼠
红细胞的溶破效应
保仔于阿氏液中的豚鼠红细胞经，洗涤后，以1×l/
100f1铺板分别加入C560.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2fg，再加
入纯化的C71孔,37oC孵育15min打¨人c8,C9各1t,.gi~L, 37℃孵育30rain一1500×g离心10min，小心吸出上清.存波长415nlll处洲吸光度.判断各孔溶血情况.
极端生命2结果
2.1C56组装时间与其溶血活性的关系
以氯胺一T氧化l0f喂C5，并与c6在37℃共孵育，组装活性(256分子存反应进行的不同时问从体系中取出1C56.以NHS作为其它终末补体成分来源.进行反应性溶破实验检测C56的溶血活性，结果见图1可以看到.C56分子组装并显示出溶fIll活性所需时间较长，在反应后24h达到最大的溶血活
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议