戈
芳1,2
曹瑞国1
朱斌1李经建1,*赵竟成
徐东升1,*
(1北京大学化学与分子工程学院，分子动态与稳态结构国家重点实验室，北京分子科学国家实验室，北京
100871;
2
三明学院化学与生物工程系，福建三明
365004)
摘要：通过自组装方法将修饰有二茂铁基团的富T 序列DNA 分子(DNA -Fc)固定在金电极表面，得到了一种 基于DNA 修饰电极的电化学汞离子(Hg 2+)传感器.当溶液中有Hg 2+存在时,Hg 2+可与修饰电极上DNA 的T 碱基发生较强的特异结合，形成T -Hg 2+-T 发卡结构，使DNA 分子构象发生改变，其末端具有电化学活性的二茂铁基团远离电极表面，电化学响应随之发生变化.示差脉冲伏安法(DPV)结果显示:DNA 末端二茂铁基团的还原峰在0.26V(vs 饱和甘汞电极(SCE))附近，峰电流随溶液中Hg 2+浓度的增加而降低;Hg 2+浓度范围在0.1nmol ·L -1-
1μmol ·L -1时，电流相对变化率与Hg 2+浓度的对数呈现良好的线性关系.该修饰电极对Hg 2+的检测限为0.1
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nmol ·L -1，可作为痕量Hg 2+检测的电化学生物传感器.干扰实验也表明，该传感器对Hg 2+具有良好的特异性与灵敏度.关键词：
生物传感器;
Hg 2+;DNA；构象变化；示差脉冲伏安法；电化学阻抗谱
中图分类号：O646
DNA Electrochemical Biosensor for Trace Hg 2+Detection
GE Fang 1,2
CAO Rui -Guo 1
ZHU Bin 1
LI Jing -Jian 1,*
XU Dong -Sheng 1,*
(1Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,State Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species,College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,Beijing 100871,P.R.China ;2Department of Chemical and
Biological Engineering,College of Sanming,Sanming 365004,Fujian Province,P.R.China )
Abstract ：In this paper we demonstrated a novel type of electrochemical Hg 2+biosensor based on a DNA -modified electrode.Ferrocenyl -modified T -rich DNA (DNA -Fc)molecules were synthesized f
or use as electrochemical probes.We then fixed these DNA -Fc probes onto a gold electrode surface by self -assembly.In the presence of Hg 2+,the single strand DNA on the electrode surface turned to a thymine -Hg 2+-thymine (T -Hg 2+-T)hairpin structure.The ferrocenyl groups were kept away from the surface of the electrode,and this could be measured sensitively by differential pulse voltammetry (DPV).The results show a reduction peak of ferrocene at 0.26V (vs saturated calomel electrode (SCE))and the peak current of DPV decreased with increasing the concentration of Hg 2+.The rate of current change is linear with
regards to lg c Hg 2+over a concentration range from 0.1nmol ·L -1to 1μmol ·L -1and with a detection limit of 0.1nmol ·L -1.
A test for interference metal ions showed that this electrochemical biosensor based on a DNA modified electrode is highly sensitive and selective,and it can be widely used for trace Hg 2+detection.Key Words ：
Biosensor;Hg 2+;DNA;Conformational change;Differential pulse voltammetry;
Electrochemical impedance spectroscopy
[Article]
www.whxb.pku.edu
物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao )
Acta Phys.-Chim.Sin .,2010,26(7)：1779-1783July Received:April 6,2010;Revised:May 27,2010;Published on Web:June 4,2010.
*
Corresponding authors.Email:lijj@pku.edu,dsxu@pku.edu;Tel:+86-10-62755948,+86-10-62760360.
The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (20573008,50821061),National Key Basic Research Special Foundation of China (2006CB806102),and National Key Basic Research Program of China (973)(2007CB936201).
国家自然科学基金(20573008,50821061)，国家重点基础研究项目特别基金(2006CB806102)及国家重点基础研究发展计划项目(973)(2007CB936201)资助项目
鬁Editorial office of Acta Physico -Chimica Sinica
1779
Acta Phys.-Chim.Sin.,2010Vol.26
近年来，许多无指示剂的传感器引起了大家的广泛关注和研究兴趣[1-2],DNA电化学生物传感器便是其中的一种.这类传感器通过键合在DNA分子上电活性基团的电化学响应变化，对目标物可实现快速灵敏的检测.已有报道的DNA电化学生物传感器在疾病诊断、基因测序、食品安全、环境检测、法医鉴定和无机离子检测等领域[3-6]，均具有良好的灵敏度和选择性.
由于生产技术的发展以及城市人口的迅速增长，环境污染逐渐演化成为一个重大的社会问题，特别是环境中的重金属污染，对人类健康构成了很大的威胁.更为严重的是，一些重金属及其化合物不能被微生物所降解，易于在活体中富集，不仅对环境中的生物造成毒害，还间接危害到人类的健康.汞是对人类健康和环境最具危害性的剧毒元素之一，人体中汞的安全浓度是0.1μg·mL-1，当其浓度达到0.5-1.0μg·mL-1时人体就会出现明显的中毒症状，从而引发一系列神经、精神等方面的疾病.美国环境保护局(EPA)确定的饮用水标准中汞的浓度上限为10 nmol·L-1[7].因此，建立一种能准确快速测定痕量汞的方法具有重要的意义.
目前，测定痕量汞的方法主要有等离子体电感耦合质谱法(ICP-MS)[8-9]、阳极溶出伏安法[10-13]、荧光探针法[14-17]等.这些方法或者需要昂贵的仪器，较长的分析周期，或者需要复杂的样品预处理步骤.
和传统的检测方法相比，基于电极表面分子构象变化的电化学生物传感器具有简单、灵敏、快速、廉价等诸多优点，新型电化学生物传感器的研究也日益受到重视.本文利用自组装方法构建了检测Hg2+的DNA 电化学生物传感器，通过电极表面DNA分子和Hg2+作用造成的构象变化，检测溶液中的Hg2+浓度.首先，在金电极表面组装修饰有二茂铁基团的富T 序列DNA探针，汞与探针分子的T碱基可形成T-Hg2+-T发卡结构[18-19]，从而使DNA构象发生改变，通过DNA末端二茂铁基团氧化还原电流的变化，实现了对痕量Hg2+的快速检测.
1实验部分
1.1试剂
DNA序列:5′-S-S-TTCTTTCTTTCCCCCCTTG TTTGTT-NH2-3′(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)；二茂铁甲酸(购自苏州永拓医药科研有限公司，经重结晶纯化)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，纯度≥99.9%，购自北京欣经科生物技术有限公司);1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亚胺(EDC，纯度≥98.5%，购自Alfa Aesar公司);N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，纯度≥99.9%，购自Alfa Aesar公司)；三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP，纯度≥99%，购自Sigma公司)；亚铁(K4Fe(CN)6，纯度≥98.5%，购自Alfa Aesar公司)；铁(K3Fe(CN)6，纯度≥99.0%，购自Alfa Aesar 公司).其他试剂均为国产分析纯.实验用水均为Milli-Q超纯水系统制备(购自Millipore公司，美国).
1.2仪器
二茂铁修饰DNA探针(DNA-Fc)的纯化采用NAP-5分离柱(illustraTM NAP-5Columns，购自GE Healthcare).电化学实验采用三电极系统：工作电极为金电极(购自天津艾达科技发展有限公司，直径3.0mm)，对电极为铂片电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE).示差脉冲伏安法(DPV)和电化学交流阻抗谱(EIS)测定在CHI650A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)及Potentiostat/Galvanostat Model 283和频率响应仪FRD100(EG&G,Princeton Applied Research,USA)上进行.
1.3实验方法
1.3.1二茂铁修饰DNA探针(DNA-Fc)的合成与纯化
二茂铁修饰的DNA探针按文献方法[20-21]合成并纯化:
EDC/NHS
5′-S-S-DNA-NH2-3′→5′-S-S-DNA-
Fc-COOH通用引物
O
||NAP-5column
NH-C-Fc-3′→DNA-Fc probe
purification
合成：用20mmol·L-1磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(PBS,pH=5.4)配制1mmol·L-1二茂铁甲酸溶液，取500μL二茂铁甲酸溶液，加入50μL 100mmol·L-1EDC(二者的摩尔比为1∶10)和125μL 100mmol·L-1NHS，反应15min.再取250μL反应产物与250μL DNA(5′-S-S-TTCTTTCTTTCCCCC CTTGTTTGTT-NH2-3′,100μmol·L-1)反应2h.
纯化：先以20mL10mmol·L-1PBS缓冲溶液(含1mol·L-1NaCl)平衡NAP-5柱，加入386μL合成DNA样品，然后加入114μL PBS缓冲溶液.之后再加入1mL PBS缓冲溶液洗脱，接取流出产物.得到的探针DNA分子置于-20℃的冰箱中保存. 1.3.2电极预处理
将金电极用Pirahna洗液(98%H2SO4与30%
1780
No.7戈芳等：检测痕量Hg2+的DNA电化学生物传感器
H2O2的体积比7∶3)浸泡30min，再依次使用1.0、0.3
和0.05μm Al2O3粉末打磨，并用无水乙醇和超纯水
超声清洗各5min，使金电极表面成光滑镜面.再将
电极置于稀硫酸溶液中进行电化学处理，至金电极
达到稳定的伏安图[22].电极表面用高纯N2吹干.
新冠疫苗生产临时性应急标准出台1.3.3探针DNA在金电极表面的自组装固定
取二茂铁修饰的探针DNA溶液(约50μmol·L-1)
10μL，加入10μL三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP,10两少一宽
mmol·L-1)，反应60min，将双硫键切断.再加入480
μL PBS缓冲溶液(100mmol·L-1)，其中含有1.5mol·
L-1NaCl,0.1mmol·L-1Mg2+,pH=7.4，将探针DNA
浓度稀释至1μmol·L-1.取50μL探针DNA溶液滴
加到金电极表面，于4℃冰箱中自组装16h.依次用
含有1mol·L-1NaCl的PBS缓冲溶液(10mmol·L-1,
pH=7.4)和超纯水淋洗电极表面以除去未组装的
DNA，得到自组装DNA修饰电极.将电极浸入PBS
缓冲溶液(100mmol·L-1，含1mol·L-1NaCl)中于4℃保存24h，将其活化.
1.3.4电化学检测
示差脉冲伏安法(DPV)实验条件：缓冲溶液为10mmol·L-1PBS(pH=7.4)，支持电解质为1mol·L-1 NaCl，扫描电位为0-0.5V(vs SCE)，阶跃电位为25 mV，扫描速率为10mV·s-1.交流阻抗法：频率范围从0.1Hz到100kHz，电解质溶液为2mmol·L-1 [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-，支持电解质为0.1mol·L-1KCl.
2结果与讨论
2.1DNA修饰电极的电化学表征
电化学阻抗谱是检测生物分子修饰电极界面结构的有力工具[23-26].我们以[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-为探针，考察DNA生物传感器在不同制备阶段中界面阻抗的性质.图1为二茂铁DNA组装前后金电极的电化学阻抗图.用Randles和Ershler等效电路对阻抗谱进行拟合(图1右上角)，所得参数列于表1.其中R s为电解质溶液电阻,C dl为界面区间电荷产生的双电层电容,Z W(Warburg阻抗)为电极反应受扩散步骤控制时的电解阻抗,R ct为界面发生氧化还原反应的电荷转移电阻.从表中数据可见，金电极表面修饰前后的R s基本一致，不受电极表面重构的影响.R ct的大小反映了电极反应的难易程度，是电极/电解质界面电子转移动力学的特征参数.DNA 组装到金电极表面，其磷酸骨架上的负电荷阻碍了[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-负离子在电极表面的电子转移，使得R ct从6.402×102Ω增大到2.014×104Ω，相差近两个数量级，证实二茂铁修饰的DNA探针已被固定到电极表面.
2.2DNA修饰电极对汞的示差脉冲伏安(DPV)电
流响应
图2为自组装电极与Hg2+作用后示差脉冲伏安法(DPV)测定其还原电流的变化.作用前DNA末端二茂铁基团的DPV还原电流为2.5μA；与100 nmol·L-1Hg2+作用后，电流减小为1.75μA，但峰电位(0.26V)基本保持不变.
将DNA修饰电极浸入不同浓度的Hg2+溶液中，检测修饰电极的DPV电流变化，如图3所示.Hg2+在0.1nmol·L-1-1μmol·L-1浓度范围内都有电化学信号的改变，还原峰值电流随Hg2+浓度的增加相应地减小，而峰电位基本保持在0.26V.以峰电流的相对变化率(i0-i)/i0(i0为无Hg2+时的峰电流,i为浸入Hg2+溶液后的峰电流)对Hg2+浓度的对数作图，如图4所示,(i0-i)/i0与lg c Hg2+在该浓度范围内呈良好的线性关系，线性系数R为0.97318，线性方程为i= 0.0783lg c Hg2++0.5327.该修饰电极对Hg2+的检测限为
a)bare gold electrode,b)DNA-Fc modified gold electrode;electrolyte
solution:2mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-+0.1mol·L-1KCl
图1金电极修饰DNA探针前(a)后(b)的电化学阻抗谱图Fig.1Nyquist plot of gold electrode before(a)and after(b)modification with DNA-Fc Inset is the modified Randle′s equivalent circuit of Nyquist plot. electrolyte solution:2mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-+0.1mol·L-1 KCl;R s:electrolyte resistance,C dl:double-layer capacitance, Z W:Warburg resistance,R ct:charge-transfer resistance
表1金电极的等效电路中各元件的拟合参数Table1Equivalent circuit parameters for gold
electrode
Curve R s/ΩC dl/μF R ct/ΩZ W/Ω
a154.0 1.713 6.402×102 2.254×10-4
b153.2 1.352 2.014×104 5.620×10-5
1781
Acta Phys.-Chim.Sin.,2010Vol.26
0.1nmol·L-1.
回看天际下中流
2.3干扰离子的检测
为了测试该DNA生物传感器对Hg2+的特异性，将DNA修饰的金电极分别浸在CaCl2、PbCl2、Mn(CH3COO)2、CuCl2、Al2(SO4)3、CrCl3、Zn(NO3)2、CdCl2等浓度为1μmol·L-1的不同溶液中进行DPV 检测，结果如图5所示.由图可见，各种金属离子(包括Pb2+、Mn2+、Ca2+、Al3+、Cr3+、Zn2+和Cd2+,Cu2+除外)的峰电流变化远远小于Hg2+，说明DNA修饰电极上的T碱基与Hg2+的结合有很好的特异性，其它金属离子对Hg2+的检测没有干扰，因此该传感器对Hg2+具有很好的选择性.检测结果中Cu2+的峰电流异常增大，可能是因为Cu2+与DNA有复杂的结合作用，使得DNA在电极表面上构象发生变化，这和文献报道的结果[2]一致.
2.4DNA电化学生物传感器的机理探讨
针对DNA在金电极表面的自组装结构有很多研究报道[27-28]，一般采用的是小分子和DNA混合组装的方法，来消除DNA和金电极基底之间的非特异性相互作用.在没有小分子自组装层的情况下，单链DNA结构柔韧易弯曲，暴露在外面的碱基很容易吸附在金电极的表面，其构象倾向于平躺在电极表面上.此时DNA末端的电化学活性基团更易接近电极表面，从而发生电子转移，表现出较强的电化学响应.当DNA发生杂交后，原本暴露在单链外侧的碱基通过互补配对转移到分子内部，使其与金电极之间的非特异性相互作用减弱，末端电化学活性基团远离电极表面，表现出明显的响应电流变化.图图4峰电流相对变化率((i0-i)/i0)与Hg2+浓度
(0.1nmol·L-1-1μmol·L-1)对数(lg c Hg2+)的关系
Fig.4Plot of relationship between peak current
change ratio((i0-i)/i0)and logarithm value of Hg2+
concentration from0.1nmol·L-1to1μmol·L-1
图2DNA探针修饰电极浸入100nmol·L-1Hg2+溶液中10min前(a)后(b)的示差脉冲伏安图
Fig.2Differential pulse voltammetry(DPV)responses of DNA-Fc modified electrode before(a)and after(b) being immersed in100nmol·L-1Hg2+for10min
图3DNA探针修饰电极检测不同Hg2+浓度的DPV图Fig.3DPV responses of DNA modified electrode
immersed in different concentrations of Hg2+
c Hg2+/(nmol·L-1):(a)0,(b)0.1,(c)1,(d)10,(e)50,(f)100,(g)500,(h)1000图5DNA修饰电极浸在1μmol·L-1的不同溶液中DPV
峰电流相对变化率(i0-i)/i0
Fig.5DPV peak current change ratio(i0-i)/i0of DNA modified electrode immersed in different solutions with concentration of1μmol·L -1
1782
No.7戈芳等：检测痕量Hg2+的DNA电化学生物传感器
6给出了传感器工作原理示意图，当将自组装电极浸入目标Hg2+中,DNA中的T碱基与Hg2+结合，形成
了T-Hg2+-T发卡结构，单链DNA刚性增强，导致链端二茂铁基团远离电极表面，电子传递受到抑制, DPV峰电流也相应地减小.
3结论
制备了末端带电化学活性基团二茂铁的巯基DNA探针，通过巯基与金的强键合作用，将其固定在金电极表面，得到单链DNA修饰电极.用电化学阻抗法对修饰电极进行了表征；利用DPV方法对目标Hg2+进行检测.在不加其它指示剂条件下，该电极在相当宽的Hg2+浓度范围内均有电化学响应，并且峰电流的相对变化率与Hg2+浓度对数在0.1nmol·L-1-1μmol·L-1范围内呈现良好的线性关系，检测限低达0.1nmol·L-1，可作为痕量Hg2+检测的DNA 电化学生物传感器.在干扰离子存在下该传感器对Hg2+有特定的选择性，能对水样中痕量Hg2+进行快速检测.本方法简便、快速，在环境保护方面具有潜在的应用价值.
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图6DNA电化学生物传感器检测Hg2+的原理示意图
Fig.6Schematic illustration of DNA electrochemical biosensor for Hg2+detection
S denotes sulfhedryl at the terminal of DNA.
1783
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