河南农业科学,2020,49(12):77-82Journal of Henan Agricultural Sciences
doi :10.15933/jki.1004-3268.2020.12.011
收稿日期:2020-03-24
基金项目：北京市科技计划课题(Z181100009318006)
作者简介：王兆芹(1976-)，女，黑龙江牡丹江人，工程师，本科，主要从事食品安全检测研究㊂ E -mail:wangzhaoqin@kwinbon
通信作者：万宇平(1982-)，男，四川眉州人，正高级工程师，本科，主要从事食品安全检测研究㊂
E -mail:beijingqinbang@163
快速检测丙溴磷
王兆芹1，张富生2，邓家军2，马玉华1，崔廷婷1,3，崔㊀娜1，万宇平1,3
(1.北京勤邦生物技术有限公司，北京102206;2.江西省农产品质量安全检测中心,
江西南昌330046;3.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京102206)
摘要：为实现蔬菜中丙溴磷的现场快速检测，采用免疫层析技术对丙溴磷残留的胶体金快速检测试纸条的制备开展研究㊂用胶体金颗粒标记丙溴磷单克隆抗体作为检测探针，以硝酸纤维素膜为固相载体，包被丙溴磷半抗原-卵清蛋白偶联物为检测线㊁羊抗鼠IgG 为质控线，建立丙溴磷的胶体金快速检测试纸条㊂结果表明，该试纸条的检出限为0.10mg /kg ㊁灵敏度96%㊁特异性93%㊁假阴 性率4%㊁假阳性率7%㊁相对准确度94.5%，重复性较好㊂胶体金试纸条操作简便㊁检测速度快㊁成本低，适用于蔬菜中丙溴磷残留的现场筛查和检测㊂
关键词：丙溴磷；单克隆抗体；胶体金免疫层析；快速检测；试纸条
中图分类号:S132㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)12-0077-06
Rapid Detection of Profenofos Using Colloidal Gold Immunoassay
Based on Monoclonal Antibody
WANG Zhaoqin 1,ZHANG Fusheng 2,DENG Jiajun 2,MA Yuhua 1,CUI Tingting 1,3,CUI Na 1,WAN Yuping 1,3
(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 102206,China;2.Testing Center of Agro-Product
Quality and Safety of Jiangxi Province,Nanchang 330046,China;3.Beijing Engineering Research Centre of
Food Safety Immunodetection,Beijing 102206,China)
Abstract :In order to realize the rapid detection of profenofos in vegetables,the preparation of colloidal gold strip for detection of profenofos was studied by immunochromatographic technique.Colloidal gold im-munochromatographic strips for rapid detection of profenofos was established by using monoclonal antibody labeled with colloidal gold particles as detection probe,and nitrocellulose membrane was used as solid carrier,profenofos-OVA conjugate as the detection line and goat-anti-rat IgG as the control line.The re-sults showed that the detection limit of the strip was 0.10mg /kg.The sensitivity,specificity,false negative rate and false positive rate of the strip were 96%,93%,4%and 7%,respectively.The relative accuracy of the strip was 94.5%with good repeatability.The developed colloidal gold immunoassay is simple in oper-ation,fast in detection,and l
ow in cost,and is suitable for on-site screening and detection of profenofos residues in vegetables.
Key words :Profenofos;Monoclonal antibody;Colloidal gold immunoassay;Rapid detection;Test strip
㊀㊀丙溴磷(Profenofos)是一种广谱高效㊁中等毒性的非内吸性有机磷杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，主杭州制氧机厂
要用于防治蔬菜水果及粮食作物上的害虫[1]㊂但随着其使用量日渐增多，必然会对环境及食品造成
河南农业科学第49卷
污染[2-3]，危害人类健康㊂目前已有研究表明，丙溴磷可破坏中枢神经系统胆碱能神经的正常功能[4-5]，还对红细胞有明显毒性[6]㊂因此，我国GB
2763 2019中规定了不同食品中丙溴磷的残留限量[7]㊂
目前已报道的检测丙溴磷残留的方法主要有谱法[8-10]和谱质谱联用技术[11-13]，这些方法灵敏度和准确度较好，但样品前处理复杂，需要昂贵的仪器设备及专业的技术人员，不适合基层实验室推广使用㊂为满足大量样品现场快速检测的需要，基于免疫层析技术，研制了丙溴磷的胶体金快速检测试纸条，具有操作简便㊁检测速度快㊁成本低等优点，适用于蔬菜中丙溴磷残留的现场快速筛查和检测㊂1㊀材料和方法 1.1㊀材料与试剂
丙溴磷(纯度ȡ99%)㊁三氯硫磷㊁四氯化碳㊁丁硫醇㊁5-溴-3-氯-2-羟基苯甲酸㊁牛血清白蛋白(BSA)㊁卵清蛋白(OVA )㊁N,N -二甲基甲酰胺(DMF)㊁N -羟基琥珀酰亚胺(NHS)㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)㊁羊抗鼠IgG㊁氯金酸㊁聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X -100)
[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]，柠檬酸三钠㊁碳酸钾(K 2CO 3)(广州化学试剂厂)，丙溴磷单克隆抗体(北京勤邦生物技术有限公司)，碳酸氢钠㊁无水乙醇㊁㊁乙腈㊁氢氧化钾(KOH)㊁乙酸乙酯㊁甲醇㊁二氯甲烷㊁蔗糖(北京化学试剂公
微弱信号检测司)，底板㊁样品垫㊁金标垫㊁硝酸纤维素膜(NC 膜)㊁吸水垫(上海捷宁生物科技有限公司)㊂1.2㊀仪器与设备
2000SBL 电子天平(美国Setra 公司)㊁SBCJ 磁
力搅拌加热器(河南圣亚仪器仪表有限公司)㊁TGL16C 台式高速冷冻离心机(湖南湘立科学仪器
有限公司)㊁XYZ 3050胶体金点样系统(美国BioDot 公司)㊁CT300数控切条机(上海金标生物科技有限公司)㊂1.3㊀试验方法
1.3.1㊀半抗原的合成㊀丙溴磷半抗原的合成如图1所示㊂取1.67g 三氯硫磷加100mL 四氯化碳溶
解，冷却到0~5ħ，加入丁硫醇1.8g㊁碳酸氢钠
0.78g，持续搅拌2h，停止反应，加入0~5ħ水
80mL，转移到分液漏斗中，快速振荡，静置分层，除
优生骨胶原
去水相，有机相浓缩蒸干得到中间体1；在中间体1中加入50mL 0~5ħ无水乙醇溶解，加无水碳酸钾
1.38g，该温度下继续搅拌1h，停止反应；加入0~
5ħ水120mL㊁150mL，充分振荡，于分液
漏斗中静置分层，除去水相，有机相浓缩蒸干得到中间体2；在中间体2中加入80mL 乙腈溶解，加5-溴-3-氯-2-羟基苯甲酸2.58g㊁KOH 1.23g，室温
搅拌3h，停止反应，旋转蒸干，加水，用乙酸乙酯萃
取，有机相用无水硫酸钠干燥处理后蒸干，用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和甲醇体积比为10ʒ1的混合溶剂洗脱分离，得到丙溴磷半抗原
㊂
图1㊀丙溴磷半抗原的合成流程
Fig.1㊀Synthesis routing of profenofos hapten
1.3.2㊀包被原的制备㊀采用活泼酯法将丙溴磷半抗原与OVA 偶联制备包被原㊂将9.3mg 半抗原溶
于1mL DMF 中，加入8.3mg NHS㊁10.1mg EDC，室温反应3h，得到半抗原溶液A 液；将50mg OVA 溶于0.05mol /L 磷酸缓冲液(PB)中，得到B 液；将
A 液滴加到
B 液中,4ħ反应12h，用0.02mol /L 磷
酸盐缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到丙溴
磷半抗原-OVA 偶联物，即为包被原，分装㊁-20ħ
保存㊂
1.3.3㊀金标抗体的制备㊀参考柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒[14]，再将丙溴磷单克隆抗体标记到
纳米金表面上㊂在磁力搅拌下，用0.2mol /L K 2CO 3
8
7
㊀第12期王兆芹等：基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丙溴磷
溶液将胶体金溶液的pH 值调节至7.2，按每1mL 胶体金溶液中加入30μg 抗体的标准向其中加入丙溴磷单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入
10%BSA 至其终质量分数为1%，静置10min㊂然
后以12000r /min 于4ħ离心40min，弃去上清液，沉淀用含0.5%BSA㊁0.05%Triton X -100的0.02mol /L 磷酸盐缓冲液洗涤2次后复溶，在4ħ下保
存备用㊂1.3.4㊀试纸条的制备㊀以包被原和羊抗鼠IgG 分别作为NC 膜上的检测线(T 线)和质控线(C 线)，采用BioDot 划膜仪进行划线，两线相隔5mm，喷量
1μL /cm，使包被原质量浓度为0.4mg /mL，羊抗鼠
IgG 质量浓度为0.2mg /mL㊂将包被好的NC 膜置
于37ħ干燥2h，备用㊂
将样品垫置于处理液中浸泡2h,37ħ干燥2h
备用；将金标垫置于处理液中均匀浸湿1h,37ħ干
燥3h 后，用喷膜仪将金标抗体按0.01mL /cm 的量
均匀喷涂在金标垫上,37ħ干燥1h，备用㊂
试纸条由底板㊁样品垫㊁金标垫㊁NC 膜和吸水
垫组成㊂依次将NC 膜㊁金标垫㊁样品垫㊁吸水垫粘贴于底板上，贴好后切成3mm 宽的试纸条，装在特制的塑料制卡中置于密封袋内，加干燥剂，密封,4ħ保存㊂
1.3.5㊀垫材处理液的优化
1.3.5.1㊀金标垫展开剂的选择㊀以含0.5%BSA
的0.02mol /L PB 作为基础液，配制A㊁B㊁C㊁D㊁E 5种不同展开剂(表1)作为金标垫处理液，并按1.3.4
步骤将液体处理到金标垫上，处理干燥后的金标垫滴加2μL 10%的金标抗体并干燥，滴加80μL 经前
处理的阴性菜心样品，观察显情况，筛选合适的金标垫展开剂㊂
1.3.5.2㊀样品垫展开剂的选择㊀将A㊁B㊁C㊁D㊁E 5
种不同展开剂(表1)按1.3.4步骤处理到样品垫上，组装试纸条后配合已确定的金标垫使用，对比5
种展开剂对胶体金层析速度㊁样品流动性的作用及显情况，筛选合适的样品垫展开剂㊂
济南莱钢钢结构有限公司表1㊀展开剂组分
Tab.1㊀Components of developing solvent
编号Number 组分Component
A P
B +0.5%BSA
B PB +0.5%BSA +2.5%蔗糖
C PB +0.5%BSA +0.05%Triton X -100
D
PB +0.5%BSA +0.1%Triton X -100+2.5%蔗糖
E
PB +0.5%BSA +0.05%Triton X -100+5.0%蔗糖
1.3.6㊀样品处理与检测㊀将新鲜样品擦去泥土
(不可水洗)，剪碎成小于1cm 的碎片或细碎小丁；称取1.0g 剪碎的样品至10mL 离心管中，加入6mL 0.02mol /L PB 缓冲液(pH 值7.0)，盖上盖
子，手动振荡30s，静置1min，上清液即为待测液㊂吸取80μL 待测液垂直滴于试纸条加样孔中，液体
流动开始计时，反应10min，肉眼判定结果㊂
若T 线显等于或强于C 线，表示待测液中不
含丙溴磷或其含量低于方法检出限，判为阴性(-)；若T 线不出现或出现但显明显弱于C 线，则结果为阳性(+)；若C 线不可见，则检测结果无效㊂1.3.7㊀试纸条性能测定
1.3.7.1㊀方法检出限㊀选取空白菜心㊁白菜㊁油麦
菜㊁豇豆样本，分别添加丙溴磷标准品至含量为0㊁0.05㊁0.10㊁0.20mg /kg，按1.3.6步骤进行前处理，用试纸条进行检测㊂
1.3.7.2㊀重复性㊀测试基质为菜心，采用空白样本及丙溴磷添加含量为0.10mg /kg 的加标样本进行
验证，取3个批号的试纸条进行检测，每一水平10平行，计算POD 值(检出阳性结果次数占所有检测结果的比率)㊂
1.3.7.3㊀其他性能指标㊀随机选取空白菜心㊁白菜㊁油麦菜㊁豇豆样本共50份，分别添加丙溴磷标准品至含量为1.3.7.1所确定的方法检出限的0.5㊁
1.0㊁
2.0倍水平，共计样品200份，用试纸条进行检测，根据‘食品快速检测方法评价技术规范“[15]计算灵敏度等性能指标㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀金标垫展开剂的选择
金标垫释放速度过快会引起释放不均匀，表现在C㊁T 线显时线条不均匀；而释放速度过慢则会影响显[16]㊂金标垫展开剂的选择主要解决金标抗体释放不均匀问题，提高释放速度㊂本研究采用5种不同配比方式的展开剂，如表2所示，不同展开剂对金标抗体释放情况影响显著,B 显最深，但均匀度不佳，影响观测效果;E 显均匀，但释放速度过慢㊂综合考虑几个性能，选择展开剂C 作为金标垫处理液㊂
2.2㊀样品垫展开剂的选择
展开剂中添加非离子表面活性剂Triton X -100，可起到增溶㊁润湿的作用；而糖类的加入可改
善界面亲水状态，从而提高样液层析的润湿效率，使层析过程更稳定[17]㊂由表3可知，不同展开剂对样本的流动速度及显差异较大㊂综合考虑层析速度
与显情况，选择展开剂E 作为样品垫处理液㊂9
7
河南农业科学
第49卷
表2㊀不同金标垫展开剂的选择结果
Tab.2㊀Selection results of different gold pad expansion agents
性能对比
Performance comparison
金标垫展开剂Gold standard pad developer
A
B
C D E
显情况Colored situation ++
+++
++
+
++
释放均匀性Release homogeneity 不均匀较均匀均匀较均匀均匀释放速度Release speed
较快较快快
慢
慢
层析速度/s Chromatography speed
65
50
7580
76㊀注: + 代表试纸条显程度, - 代表不显，肉眼无法观察，下同㊂
㊀Note: + represents the color rendering degree of the strip, - represents no color rendering,and cannot be observed by the naked eye,the same below.
表3㊀不同样品垫展开剂的选择结果
Tab.3㊀Selection results of different sample pad expansion agents
性能对比
Performance comparison
样品垫展开剂Sample pad expansion agent
A
B
C
D
E
显情况Colored situation
++++++++++++层析速度/s Chromatography speed
83
79
67
78
55
2.3㊀方法检出限的测定
由图2可知，当丙溴磷含量不断上升时，试纸条
T 线颜由深变浅㊂当丙溴磷含量为0.10mg /kg
时，观察到T 线颜明显弱于C 线，因此确定试纸条对丙溴磷的检出限为0.10mg /kg㊂
2.4㊀重复性测试
由表4可知,3个不同批号试纸条的检测结果中，仅批次2的试纸条在检测中出现阳性反应，其他无明显差异，表明方法重复性较好
㊂
图2㊀试纸条检出限测试结果
Fig.2㊀
Detection limit test results of test strip
表4㊀试纸条重复性测试结果
Tab.4㊀Repeatability test results of test strip
试纸条批次
Batch of test strip
空白样品Blank sample
加标样品Spiked sample
数字信号发生器
1POD 0mg /kg =0/10=0㊀
POD 0.10mg /kg =10/10=1
2POD 0mg /kg =1/10=0.1POD 0.10mg /kg =10/10=1
3
POD 0mg /kg =0/10=0㊀
POD 0.10mg /kg =10/10=1
2.5㊀其他性能指标测试
根据‘食品快速检测方法评价技术规范“，试纸条灵敏度㊁特异性㊁假阴性率㊁假阳性率㊁相对准确度各性能指标的计算方法及结果见表5㊂试验中共计
样品200份，其中阴性100份(包括空白样品和添加含量为0.5倍检出限的样品各50份)，阳性100份(包括添加含量为检出限和2倍检出限的样品各50份)㊂
表5㊀性能指标计算方法及结果Tab.5㊀Calculation method and results of
performance index
样品情况
Sample situation
检测结果Detection result
王从义中国美术学院阳性Positive
阴性Negative
总数Total 阳性Positive 964100阴性Negative 793100总数Total
103
97
200
灵敏度p +/%Sensitivity
p +=96/100ˑ100=96
8
㊀第12期王兆芹等：基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丙溴磷续表5㊀性能指标计算方法及结果
Tab.5(Continued)㊀Calculation method and results of
performance index
样品情况
Sample situation检测结果Detection result
阳性Positive阴性Negative 总数Total
特异性p-/%
Specificity p-=93/100ˑ100=93
假阴性率pf-/%
False negative rate pf-=100-p+=4
假阳性率pf+/%
False positive rate pf+=100-p-=7
相对准确度/%
Relative accuracy(96+93)/200ˑ100=94.5
3㊀结论与讨论
目前还没有关于丙溴磷的胶体金免疫层析方法的报道，仅是开发针对有机磷类农药的单克隆抗体并建立免疫检测方法，如刘贤进等[18]设计采用二乙基膦酸乙酸作为通用结构半抗原，用NHS-DCC法和EDC法合成2种人工抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清，所得抗体对毒死蜱㊁氧乐果㊁二嗪农㊁乙基对硫磷㊁丙溴磷㊁辛硫磷等农药有特异性反应,50%抑制浓度(IC50)分别为0.12㊁0.21㊁0.24㊁0.78㊁0.97㊁3.80μg/mL；张丽杰等[19]制备针对乙氧基磷酸酯类有机磷农药的单克隆抗体，对毒死蜱㊁对硫磷㊁丙溴磷㊁氧化乐果㊁除线磷㊁二嗪农㊁溴硫磷㊁辛硫磷㊁喹硫磷㊁三唑磷等农药有特异性反应，并以此为基础建立了该类农药的快速免疫筛选检测方法；朱亮亮等[20]通过制备有机磷农药半抗原，研制出一种能够检测蔬菜㊁水果中有机磷农药的胶体金免疫层析试纸条，对辛硫磷㊁对硫磷㊁丙溴磷㊁氯唑磷的检测限均为200μg/kg㊂上述研究都是以有机磷农药的共有特征结构为基础制备半抗原，免疫所得单克隆抗体可以检测多种农药，针对丙溴磷检测的特异性较差㊂本研究通过在丙溴磷的苯环上引入羧基活性基团制备得到半抗原，该半抗原保留了丙溴磷的所有特征基团，最小改变丙溴磷原有结构特征，同时与载体蛋白偶联后，突出的是丙溴磷本身独有的含磷部分的结构，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强㊁灵敏度更高的抗体奠定了基础；基于此半抗原制备的丙溴磷快速检测试纸条，可特异性地快速检测蔬菜中的丙溴磷，检出限达到0.10mg/kg；灵敏度96%㊁特异性93%㊁假阴性率4
%㊁假阳性率7%㊁相对准确度94.5%，重复性较好，检测速度快，从制样到得出结果仅需15min㊂
本试纸条与仪器方法相比，具有操作简便㊁检测速度快㊁成本低等优点，但由于胶体金免疫层析法主要通过肉眼观察颜来判断结果，可能出现假阳性等问题㊂因此对于阳性样品，还需要用仪器方法进行确证㊂尽管如此，该方法作为一种快速筛查手段，可广泛用于蔬菜中丙溴磷残留的现场筛查和检测，具有重要的经济价值和社会价值㊂
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Rural Affairs,State Administration for Market Regulation.
National food safety standard maximum residue limits for
18
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