基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜对肌红蛋白的吸入及其电化学研究 人口结构姚惠琴;黄珊;苏巧玲;史可人;甘倩倩;王明科
【摘 要】合成了既含有苯硼酸(PBA)基团又含有羧酸基团的聚电解质PAA-PBA(PAA:聚丙烯酸).采用层层组装(LbL)技术,利用PAA-PBA和葡聚糖(Dex)之间的硼酸-二醇特异性识别作用,在热解石墨电极(PG)表面构筑了{ PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜,该薄膜从溶液中吸入肌红蛋白(Mb)形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜.采用循环伏安方法研究了{ PAA-PBA/Dex}n薄膜中Mb的直接电化学及对氧气和过氧化氢的电催化还原过程.结果表明,该薄膜为保持Mb的生物活性提供了良好的微环境,是一种新型的可固定蛋白质的LbL薄膜,为设计基于酶的直接电化学生物传感器提供了新思路. lpk【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】突变体2016(037)005
【总页数】8页(P938-945)
【关键词】直接电化学;电催化;层层组装;硼酸-二醇特异性识别作用;肌红蛋白雷海清
【作 者】姚惠琴;黄珊;苏巧玲;史可人;甘倩倩;王明科
【作者单位】宁夏医科大学药学院,基础医学院,银川750004;宁夏医科大学药学院,基础医学院,银川750004;宁夏医科大学药学院,基础医学院,银川750004;宁夏大学能源化工国家重点实验室,银川750021;宁夏医科大学药学院,基础医学院,银川750004;宁夏医科大学药学院,基础医学院,银川750004
【正文语种】中 文
【中图分类】O646;O657.1
氧化还原蛋白质或酶在基底上的固定是不依赖于媒介体的电化学生物传感器、 生物反应器及其它生物装置的重要前提, 已引起了研究者的广泛关注[1]. 在固体表面固定酶或蛋白质并有效实现蛋白质直接电化学的方法之一是将其固定在修饰于电极表面的薄膜中[2]. 在各种制备薄膜的方法中, 层层组装(LbL)技术表现出显著的优势, 它能够根据预先设计的方案在纳米或分子层次上控制薄膜的组成与厚度, 且组装程序非常简便[3,4]. LbL组装的成膜驱动力既包括静电作用力也包括各种非静电作用力, 如离子-偶极作用力、 氢键作用和特异性相互
作用等[5,6]. 在各种特异性相互作用中, 硼酸基团和二醇单元之间的相互作用在构筑薄膜方面引起了许多研究者的兴趣[7～12]. 苯硼酸(PBA)及其衍生物能够与各种1,2-或1,3-顺二醇化合物(如多元醇、 糖类化合物)之间形成共价键, 并生成五元或六元环状的硼酯复合物[13]. 如聚乙烯醇或甘露糖可以与含有PBA基团的聚电解质构筑LbL薄膜[10,11]. 1个单糖分子通常含有5个—OH基团, 而1个PBA基团可以与2个—OH基团结合, 因此它们可以形成1∶2型糖-PBA复合物[10,14]. 葡聚糖(Dex)是以葡萄糖为单体的聚多糖, 其分子骨架上含有多个可以与PBA基团结合的葡萄糖单元[10,15]. 虽然Dex和PBA之间的特异性亲和作用已有报道, 但是由Dex与含有PBA基团的聚电解质构筑的蛋白质层层组装薄膜至今未见报道.
吸入型蛋白质LbL薄膜是一种新型的蛋白质LbL薄膜[3,16～18], 它通过将固体基底表面组装的聚合物和/或纳米粒子LbL薄膜浸泡在蛋白质溶液中, 使蛋白质自发吸入薄膜而形成. 与通常的直接用蛋白质和其它组分构筑的蛋白质LbL薄膜相比, 吸入型蛋白质LbL薄膜中的蛋白质是自发地扩散进入薄膜内部, 并且独立于LbL薄膜的组装过程, 因此该方法在保持蛋白质的原有结构和生物活性方面表现出独特的优点. 在电极上构筑不同类型的吸入型蛋白质LbL薄膜的研究已有报道, 并实现了氧化还原蛋白质在该类型薄膜电极上的直接电化学[19,20].
本文首先通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸(PAA)羧基之间的缩合反应将PBA基团接枝到PAA骨架上, 得到产物PAA-PBA[11]; 然后利用PAA-PBA与Dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用, 在热解石墨(PG)电极表面上组装{PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜, 最后再从溶液中吸入Mb, 制得{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜. 该薄膜为保持Mb的生物活性提供了良好的微环境, 并实现了Mb在薄膜中的直接电化学及其对氧和过氧化氢的电催化还原, 扩展了蛋白质LbL薄膜成膜材料的范围, 有助于发展新型的基于蛋白质或酶直接电化学的电化学生物传感器.
1.1 试 剂
马骨骼或肌肉肌红蛋白(Mb, MW≈17800)、 3-氨基苯硼酸半硫酸盐(APBA)、 聚丙烯酸(Mw≈100000, 质量分数35%水溶液)、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 纯度99.5%)、 N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基丁二胺磺酸钠(NHS)、 葡聚糖(Mw≈200000)和壳聚糖(CS, 酰胺化程度大于85%, Mw≈200000)、 醋酸钠和磷酸二氢钠均为分析纯, 购自Sigma-Aldrich公司. K3Fe(CN)6、 K4Fe(CN)6和过氧化氢(H2O2, 质量分数30%)购自北京化工厂. 缓冲溶液为0.1 mol/L的醋酸钠溶液(pH=4.0～6.0)、 0.05 mol/L的磷酸二氢钠溶液(pH≈7.0～8.5)和0.05 mol/L的硼酸溶液(pH=9.0), 用稀HCl或KOH溶液调节到
所需pH值, 缓冲溶液中均含有0.1 mol/L NaCl. 所有溶液均用经过离子交换和蒸馏纯化的三次蒸馏水配制. 实验用水均为经过离子交换和蒸馏纯化的三次水.
1.2 PAA-PBA的合成
根据文献[19,21], 使PAA与APBA在交联剂NHS和EDC的存在下发生缩合反应, 将PBA接枝到PAA骨架上来合成PAA-PBA聚电解质使, 其合成路线如Scheme 1所示, 具体过程如下: 将0.57 g PAA水溶液(含有2.77 mmol单体)用HEPES缓冲溶液(20 mL, 50 mmol/L)稀释, 将溶液pH值调至8.5; 将APBA(20 mL, 61 mmol/L)同样溶于pH=8.5的HEPES缓冲溶液(20 mL, 50 mmol/L)中; 然后将上述2种溶液混合, 再滴入含有NHS(4 mL, 31 mmol/L)的HEPES缓冲溶液(50 mmol/L, pH=8.5), 并搅拌10 min. 将含有EDC(4 mL, 310 mmol/L)的HEPES缓冲溶液(50 mmol/L, pH=8.5)加入到上述反应混合溶液中, 室温下搅拌12 h. 然后将上述溶液透析7 d以除去所有小分子量的杂质, 冷冻干燥后得到白粉末状固体产物PAA-PBA.
1.3 {PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜的组装
连枷胸PG电极的制作: 用热缩管将直径为4.5 mm、 长为6 mm左右的圆柱型Basal plane PG(Adv
anced Ceramic公司)密封在直径与之相等的不锈钢圆柱棒一端. 使PG的一侧表面紧贴在不锈钢棒一端的表面, 从而形成导电通路, 而PG的另一侧表面作为电极表面. 将电极表面在320目的金相砂纸上打磨后, 再在蒸馏水中超声30 s, 洗净吹干后作为实验中的工作电极. 电极表面的几何面积为0.16 cm2.
将处理好的PG电极首先在带有正电荷的CS溶液(1 mg/mL, pH=5.0)中浸泡15 min, 使之在PG表面吸附一层CS前驱膜. 然后将PG/CS电极交替浸入带有负电荷的PAA-PBA(1 mg/mL, pH=9.0)和中性Dex(1 mg/mL, pH=9.0)水溶液中各15 min, 溶液转换时用水清洗并吹干, 可在电极表面形成一个PAA-PBA/Dex双层. 重复上述过程直到在PG/CS表面上形成所需双层数(n)的{PAA-PBA/Dex}nLbL薄膜. 将组装好的上述薄膜电极浸入1 mg/mL的Mb溶液(pH=5.0, 含0.2 mol/L NaCl)中使Mb分子扩散到薄膜内部, 然后取出洗涤并吹干, 制得薄膜{PAA-PBA/Dex}n-Mb. 然后将固载了Mb的薄膜转移到pH=7.0的空白缓冲溶液中进行电化学研究.
1.4 测 试
电化学测试采用CHI 660A型电化学工作站(美国CHI仪器公司), 使用典型的三电极体系, 参
比电极为饱和甘汞电极(SCE), 辅助电极为铂电极, 工作电极为修饰有LbL薄膜的PG电极. 电解池中的缓冲溶液为不含蛋白质的空白缓冲溶液. 在电化学测试前, 向缓冲溶液中通入高纯氮气10 min以除去溶液中的氧气, 并在整个实验过程中始终保持氮气氛围(O2催化实验除外). 电化学阻抗谱(EIS)测试以等浓度的Fe(CN)和溶液(5 mmol/L, 含0.1 mol/L NaCl)作为电活性探针, 在其式量电位0.17 V(vs. SCE)上施加小振幅的正弦交流电压, 振幅为±5 mV, 频率范围为0.1～105 Hz. 扫描电子显微镜(SEM)观测采用S-4800冷场发射扫描电子显微镜(Hitachi公司), 加速电压为3 kV, 以组装在PG电极上的LbL薄膜作为测试样品. 在SEM观测之前, 采用E-1045离子溅射仪(Hitachi公司)在样品表面镀一层铂膜. 所有实验均在室温[(20±2) ℃]下进行.
2.1 {PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜的层层组装
打磨后的PG电极暴露出一些棱面(edge面), 因此既具有疏水性也具有亲水性. 由于棱面的碳被氧化后连接有O-, OH-等基团, 因此表面带有负电荷[22]. CS在pH=5.0时因pKa≈6.5[23]而带有正电荷, 因此可以作为前驱膜吸附在PG电极表面[22]. PAA-PBA的分子骨架中含有大量的自由的—COOH基团, PAA在水溶液中的pKa约为6.0[24～27], 因此在pH=9.0时PAA-PB
A中自由的羧基被离子化而带负电荷, 这样带负电荷的PAA-PBA可以被静电吸附到带有相反电荷的PG/CS膜表面. 因此PG电极与CS之间、 CS与PAA-PBA之间的组装驱动力主要是静电作用力. 后续组装的Dex是一种不带电荷的中性聚多糖, Dex在PAA-PBA表面的吸附以及后续{PAA-PBA/Dex}n多层膜的组装主要通过硼酸-二醇特异性识别作用相结合.
图1为以K3Fe(CN)6为电活性探针监测的{PAA-PBA/Dex}n薄膜在PG电极表面的循环伏安曲线. 在裸的PG或PG/CS薄膜电极上, K3Fe(CN)6在pH=7.0的溶液中于0.17 V附近出现一对良好的、 近乎可逆的氧化还原峰. 而当{PAA-PBA/Dex}n LbL薄膜组装到PG/CS表面后, 探针的氧化还原峰电流显著下降, 这是因为在电极表面形成的薄膜屏障阻碍了探针到达底层的电极表面并进行电子交换. 随着薄膜双层膜数n的增加, K3Fe(CN)6的电流逐渐降低, 由此表明在PG电极表面构筑了{PAA-PBA/Dex}n多层薄膜.
2.2 {PAA-PBA/Dex}n薄膜对Mb的吸入
在合适的条件下, Mb能够从其水溶液中被自发地吸入到{PAA-PBA/Dex}n薄膜之中, 形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜. 图2是以Fe(CN)3-/4-6为电活性探针裸的PG电极、 PG/CS薄膜电极和PG/CS/{PAA-PBA/Dex}6薄膜电极的电化学阻抗谱. 对于裸的PG电极和PG/CS薄膜
电极, Fe(CN)3-/4-6的EIS响应在pH=7.0的溶液中都表现为一条Warburg直线(图 2曲线a和b), 这是受扩散控制的电化学过程的特征. {PAA-PBA/Dex}6薄膜在Mb溶液中浸泡9 h后, 在高频区可以观察到1个明显的半圆形响应(曲线d), 其EIS响应的半圆直径远远大于吸入Mb之前的{PAA-PBA/Dex}6薄膜的半圆直径(曲线c). 半圆的直径通常等于探针的电荷转移电阻[28]. 对于薄膜体系, 电荷转移电阻主要反映了探针在薄膜中扩散的难易程度, 与薄膜的通透性直接相关[29]. 由此说明吸入{PAA-PBA/Dex}6薄膜中的Mb作为物理屏障进一步阻碍和限制了探针到达电极表面, 从而反过来证实了Mb在薄膜中的吸入.
Mb的等电点为6.8[30], 其表面净电荷在pH=5.0时为正. 而{PAA-PBA/Dex}6薄膜是由带负电荷的PAA-PBA和不带电荷的Dex两种成膜材料组成, 因此{PAA-PBA/Dex}6薄膜带负电荷. 在pH=5.0条件下, 带负电荷的薄膜将吸引带正电荷的Mb. 因此, Mb和{PAA-PBA/Dex}6薄膜中PAA-PBA组分之间的静电吸引力也是促使薄膜吸入Mb的另一重要驱动力.公共厕所TOILET
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