磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP介导的磁热作用可有效抑制肝癌的生长 郑权;高鹏;李晓锋;李海量
【摘 要】目的 观察磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP介导的磁热对肝癌的影响.方法 合成磁性纳米粒子复合物,并将与肝癌细胞HepG2共同孵育,并将其分为纳米粒磁热组、纳米粒组和对照组.普鲁氏蓝染法检测HepG2细胞对磁性纳米粒子的摄取效率;MTT法检及流式细胞术测磁性纳米粒子对HepG2的抑制效果;激光共聚焦检测磁性纳米粒子在细胞内产生活性氧自由基(ROS)水平;将裸鼠植瘤,并将其分为PEG-APTES-MNP组(只注射磁性纳米复合物)、PEG-APTES-MNP(Heat)组(注射磁性纳米复合物并进行磁热)和对照组(注射等体积PBS),每组5只,分别进行并检测其在动物水平对肿瘤的抑制作用.结果 合成的磁性纳米复物表征准确;血细胞凝集实验表明其不会引起血细胞的聚集,具有良好的理化性质和生物相容性;在肿瘤细胞HepG2内可以产生大量活性氧自由基,在体外实验中协同磁热对其增殖产生了更强的抑制效果(P<0.05),并促进细胞凋亡;在体内实验中,其介导磁热的作用下可以有效抑制肝癌动物模型肿瘤生长(P<0.05).结论 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP具有良好的理化性质和生物相容性,其介导的磁热作用可有效抑制HepG2细胞及肝癌动物模型肿瘤生长,可以作为肝癌的潜在纳米药物. 晏子春秋内篇谏上
【期刊名称】帮练下腰致其伤残《南方医科大学学报》
【年(卷),期】2019(039)008
【总页数】7页(P891-897)
【关键词】肝癌;磁性纳米粒子;热疗;活性氧自由基;细胞凋亡
【作 者】郑权;高鹏;李晓锋;李海量
【作者单位】广东省第二人民医院普外二科,广东 广州 510317;广东省第二人民医院普外二科,广东 广州 510317;广东省第二人民医院普外二科,广东 广州 510317;广东省第二人民医院普外二科,广东 广州 510317
【正文语种】中 文
肝癌的发病率在所有肿瘤中位居第6，死亡率位居第4，我国肝癌的发病人数占全球总数的一半，是造成60岁以上男性死亡的第一大肿瘤杀手［1-2］。过去30年肝癌肝癌5年总生存率仅为10.1%［2］，需要寻新的方法。
热疗是恶性肿瘤放化疗外的一种辅助疗法，它是将器官或组织加热到一定温度，引起肿瘤细胞死亡的方法［3］。利用磁性纳米粒子（MNP）靶向肿瘤细胞，对肿瘤细胞精准热疗成为当下研究的热点［4-6］。我们前期合成了聚合物PEG-PLL-FA修饰的共载顺铂和TFPI2质粒的磁性纳米粒子，并将其应用于鼻咽癌靶向和成像，在体外取得了良好效果［7］。本研究是在前期工作的基础上，合成一种具及良好生物相容性、在高频交变磁场作用下具有磁热且具有良好生物相容性的磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP。有研究已将其用于MRI成像，显示了良好的成像效果［8］，说明其具有良好的磁性，具有作为肝癌磁热纳米药物的潜力，目前并无相关报道。本研究将PEG-APTES-MNP纳米复合物经尾静脉脉注射至肝癌模型肿瘤部位，在高频交变磁场作用下磁性纳米粒子发热并对肝癌进行。通过激光共聚焦、MTT、动物肿瘤生长实验等检测肝癌模型肿瘤内的活性氧自由基情况及对肝癌的抑制作用效果，为肝癌辅助提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
FeCl3·6H2O、FeSO4·4H2O、羧基聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）相对分子质量
2000、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、邻二氮菲、氨水购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，BALB/C裸鼠（雄性，6～8周龄）购自北京维通利华实验动物有限公司，普鲁氏蓝染试剂盒、活性氧自由基（ROS）检测试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP理化性质检测 化学共沉淀法制备聚乙二醇（PEG）、氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）修饰的磁性纳米粒子（MNP）PEGAPTES-MNP［7］，检测其稳定性与磁性。常温下将PEGAPTES-MNP与未修饰的磁性纳米粒子分别放置24 h，观察其沉降情况。将PEG-APTES-MNP行T1MRI成像，参数设置如下：TR/TE（重复时间/回声时间，Repetition time/Echo time）3000/80 ms，视场180 mm，层厚2.0 mm，层距1 mm。将PEG-APTES-MNP置于高频交变磁场中，检测其磁热效率，设置磁场功率为1.0 kW，时间为5 min，红外相机进行成像。邻二氮菲分光光度法检测样品铁含量。
1.2.2 细胞普鲁氏蓝染 将磁性纳米复合物PEGAPTES-MNP与HepG2细胞共同培养6 h，将细胞用4%多聚甲醛固定并用普鲁士蓝染试剂盒染，然后通过显微镜观察细胞。
1.2.3 磁热处理后细胞活性检测 取HepG2细胞，将细胞消化计数并接种到96孔板（3000/孔），24 h后将不同浓度磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP和MNP分别加入细胞培养液中，对照组加等体积PBS，继续培养。4 h后，吸收培养基并用新鲜培养基替换，并置于高频交变磁场中（1.0 kW，15 min），24 h后行噻唑蓝（MTT）检测。将细胞接种到6孔板（105/孔）中，然后培养24 h。将PEG-APTES-MNP和MNP（通过铁的浓度计数，10 μg/mL）分别加入细胞中，设置未处理细胞为对照。4 h后，吸收培养基并用新鲜培养基替换，并置于高频交变磁场中（1.0 kW，10 min）。细胞继续培养4 h。细胞用胰蛋白酶消化并重悬于100 mL PBS中。细胞用试剂盒染后，通过流式细胞术检测细胞凋亡率。
1.2.4 细胞ROS水平检测 将磁性纳米复合物PEGAPTES-MNP与HepG2细胞共同培养6 h，将细胞用4%多聚甲醛固定并用ROS染试剂盒及DAPI染，然后通过激光共聚焦显微镜观察细胞。
1.2.5 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP生物相容性检测 依据先前文献的报道［7］。小
鼠静脉采血，4℃、4000 r/min离心5 min，弃上清。相同方法将血细胞用PBS洗涤3次。将聚合物PEG-APTES-MNP以100μg/mL的终浓度加入血液悬浮液样品中。轻轻混合，室温下孵育15 min后涂片，通过倒置光学显微镜检测观察血细胞凝集的程度。
情报杂志1.2.6 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP介导的磁热对肝癌肿瘤模型的影响 将HepG2细胞消化接种于BALB/C裸鼠背部，1周后肿瘤约生长至5 mm大小。此时开始。分别经尾静脉给药注射PBS，PEGAPTES-MNP，剂量为30 mg/kg，注射结束将一磁铁固定于肿瘤部位2 h，以使磁性纳米复合物富集于肿瘤部位。注射PEG-APTES-MNP的小鼠进一步分为2组，一组置于高频交变磁场中（2.0 kW，15 min）行磁热，每周给药1次，一组不进行磁热。3组小鼠（每组5只），共3周，观察记录肿瘤变化。
1.3 统计分析
tek062用Graphpad Prism 8软件进行统计分析，数据采用均数±标准差，组间比较采用方差分析，P＜0.05时差异有统计学意义。
2 结果
2.1 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP的表征
芳纶头盔
APTES修饰MNP后其红外光谱图1486.5位置出现氨基特征峰（图1A）。其与PEG继续反应后，其平均水流动力学粒径大小为152.8 nm，而未修饰的MNP其平均水流动力学粒径为1754.7 nm；Zeta电位的结果与水流动力学粒径结果一致，修饰前后的电位值分别为0和-28.1 mV（图1B）。其透射电镜（TEM）大小分布为39.4±6.28 nm（图1D）。MNP修饰后较修饰前在水溶液中分散得更好（图1C）。利用邻二氮菲分光光度法测得PEG-APTES-MNP的铁含量为0.49±0.004mg/mL（图1E）。
2.2 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP的理化性质
图1 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP的表征Fig.1 Characterization of the nanocompound PEG-APTES-MNP.A:IR spectrum;B:Particle size and Zeta potential;C:Stability in water;D:Transmission electron microscopy;E:Standard curve of iron content.
为了证明磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP是否有足够的磁性，我们将一强磁铁置于样品
一侧，大约10 min后水溶液中的样品（图2A）。同时，我们将不同浓度的样品行T1 MRI成像，成像显示，随着样品浓度的增加，其信号强度也随之增加，而对照组信号几乎无任何改变（图2B）。将样品与对照组放置于功率为1.0 kW的高频交变磁场下，10 min后对照组温度无明显变化（24.2℃），而样品则温度迅速升至57.3℃（图2C）。
图2 磁性纳米复合物PEG-APTES-MNP的理化性质Fig.2 Physiochemical property of the nanocompound PEG-APTES-MNP.A:Magnetism;B:Magnetic resonance imaging(MRI);C:Infrared thermal imaging.
2.3 磁性纳米复合PEG-APTES-MNP可被HepG2细胞大量摄取
节电技术我们进一步观察磁性纳米复合PEG-APTES-MNP是否可以被肿瘤细胞摄取，进而在肿瘤细胞内部对其进行杀伤。磁性纳米复合PEG-APTES-MNP与肝癌细胞HepG2共同孵育6 h后，其被细胞大量摄取，而在细胞内被普鲁氏蓝染成蓝，而对照组几乎没有蓝染（图3）。
图3 PEG-APTES-MNP被HepG2细胞摄取后的普鲁氏蓝染图Fig.3 Prussion blue staining of HepG2 cells incubated with PEG-APTES-MNP.
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