pH敏感磁靶向纳米给药系统的构建及其对HepG2肿瘤细胞的作用 马红岩;乔桂红
【摘 要】目的:构建一种新型的磁性靶向pH敏感控释纳米给药系统并考察其对HepG2肿瘤细胞的抑制作用.方法:将四氧化三铁(Fe3O4)衍生至碳纳米管(CNTs)表面,使用聚乙烯亚胺/聚乙二醇对载体进行修饰,利用聚乙烯亚胺具有的丰富的氨基末端与阿霉素(DOX)结合,通过具有pH敏感的腙键相连构建CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX给药系统;分别使用透射电镜(TEM)、X射线衍射仪(XRD)、傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、磁强计(VSM)对给药系统进行相关表征分析,考察给药系统热疗升温、载药及pH敏感释放情况;将培养的HepG2肿瘤细胞分为空白对照组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG组、PTT热疗组、DOX组、DOX联合PTT热疗组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX联合PTT热疗组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向联合pTT热疗处理组,使用MTT法检测以上8组中HepG2细胞的抑制率.结果:成功构建CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX纳米给药系统,DOX的载药率为65.04％,pH值降低时,DOX的累计释放率明显迅速升高;该给药系统的磁化强度为19.92 emu/g,具有明显的磁性靶向性;CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX在近红外光照射下可在5 min内迅速升温至(58.7±2.5)℃,
五月的鲜花2012具有明显的热疗升温作用;给药系统联合热疗对肿瘤细胞具有明显的抑制作用.结论:CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX是一种新型的具有磁性靶向、pH敏感控释以及热疗作用的多功能智能化的给药系统,对HepG2肿瘤细胞有较强的抑制率.
【期刊名称】《贵阳医学院学报》
【年(卷),期】思想政治工作研究2016(041)009
【总页数】7页(P1047-1052,1060)
【关键词】磁靶向;碳纳米管;pH敏感;阿霉素;热疗
【作 者】马红岩;乔桂红
【作者单位】商丘医学高等专科学校临床医学系,河南商丘476005;商丘医学高等专科学校临床医学系,河南商丘476005
【正文语种】中 文
【中图分类】R943
阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种临床上常用的广谱抗癌药物，但其过程中伴随的心脏毒性限制了它的应用[1]。通过纳米载体构建一种可以有效输送DOX到达病变部位，且能在靶向部位控释的给药系统是该类研究的新思路[2]。研究表明，肿瘤部位较正常组织pH值低，利用肿瘤组织与正常组织pH值的差别，构建一种具有pH敏感的控释系统是降低化疗药物毒性的有效途径[3]。近年来，多功能智能化肿瘤靶向纳米给药系统逐渐成为科学家研究的新方向[4-5]。碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)是一种纳米材料，具有多种独特的物理化学性能，可作为多种药物及生物大分子的载体，但单纯的载药并不能满足的需求，给药系统的靶向性是药物能够有效到达靶向部位的关键[6-7]。含有四氧化三铁(Fe3O4)的抗肿瘤给药系统可以通过磁靶向作用将药物准确靶向到肿瘤部位，提高药物的效果，减轻毒副作用[8]。本研究将Fe3O4对CNTs进行衍生化，使用聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)对载体进行功能化，从而改善CNTs的生物相容性，降低其毒性，提高其体内长循环特性。
1.1 仪器与材料
盐酸DOX(上海晶纯生化科技股份有限公司)，RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公 司)，羧基化聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，COOH-PEG2000，国药集团化学试剂有限公司)，羧基苯肼(4-hydrazinobenzoic acid，HBA)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI，MW=25 000)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochlorid，EDC]、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS，)、二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC，)及其他试剂均购自美国Sigma公司，人乳腺癌MCF-7细胞系(上海复祥生物科技有限公司)。透射电镜(TEM，Tecnai G2 20型，荷兰FEI公司)、X射线衍射仪(XRD，7000S/L型，日本岛津公司)、傅里叶红外光谱仪(FT-IR，FTIR-7600型，澳大利亚Lambda公司)、磁强计(VSM，型号BHV-55，日本理研电子公司)。
1.2 羧基化CNTs(CNTs-COOH)的制备
称取多壁CNTs-COOH 120 mg，置于250 mL圆底烧瓶中，加入混酸溶液(V浓硫酸∶V浓硝酸=3∶1)120 mL，并加入30%过氧化氢12 mL，超声波清洗4 h后，用超纯水稀释，使用0.45 μm微孔滤膜和布氏漏斗抽滤，超纯水冲洗至pH为中性为止，放入烘箱中80 ℃恒温干燥，即得CNTs-COOH。
女头人1.3 磁性碳纳米管(CNTs-Fe3O4-COOH)的制备
钱塘江漩涡原因乔称CNTs-COOH 20 mg置于100 mL圆底烧瓶中，加入乙二醇-二甘醇混合溶液(V乙二醇∶V二甘醇=1∶19)20 mL，并使CNT均匀的分散在混合溶液中，然后依次缓慢加入醋酸钠0.3 g和FeCl3·6H2O 0.108 g。将上述液体转入聚四氟乙烯内衬高压反应釜并置于200 ℃干燥箱中，保温10 h后自然冷却至室温。将反应釜内产物用无水乙醇和超纯水反复洗涤，真空干燥12 h，即得CNTs-Fe3O4-COOH。
1.4 CNTs-Fe3O4-COOH的功能化
将 CNTs-Fe3O4-COOH 200 mg溶于二氯甲烷中50 mL，加入过量PEI及DCC，超声30 min后，冷凝回流反应48 h。使用磁铁收集反应成功的CNTs-Fe3O4-PEI，超纯水洗涤3次，冷冻干燥。将 CNTs-Fe3O4-PEI 50 mg溶于PBS缓冲液50 mL中(pH 7.4)，加入 PEG-COOH 1 mg、EDC 50 mg及NHS 25 mg，室温搅拌反应24 h，使用磁铁吸附CNTs-Fe3O4-PEI/PEG，超纯水洗涤3次，冷冻干燥备用。
1.5 CNTs-Fe3O4-COOH负载DOX
将CNTs-Fe3O4-PEI/PEG 50 mg和HBA 50 mg加入PBS缓冲液50 mL 中(pH 7.4)，然后加入EDC 50 mg及NHS 25 mg，室温下搅拌反应48 h。使用磁铁收集CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA，乙醇洗涤3次，冷冻干燥备用。称取CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA 50 mg与DOX 80 mg一同加入到DMSO中，室温搅拌避光反应24 h。使用磁铁吸附CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX，除去未反应完成的杂质，超纯水洗涤吸附物3次，冻干备用。CNTs-Fe3O4-PEI/PEG的FT-IR图中出现的明显的C-H(2 885 cm-1,3 450 cm-1)振动峰，表明其合成成功[9]。CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA出现了新的酰胺特征峰(1 654 cm-1,1 375 cm-1)，-NH2弯曲振动峰(1 600 cm-1)，表明HBA已被连接至CNTs表面。1 654 cm-1和1 375 cm-1处的特征峰表明DOX已通过腙键连接至CNTs-Fe3O4-PEI/PEG[10]。
1.6 给药系统的表征
分别使用TEM、XRD、FT-IR、VSM对制备好的给药系统进行表征，并考察给药系统在808 nm近红外光下产热情况。
1.7 给药系统载药量及pH敏感释放性质考察
使用Lambda 35型可见光-紫外扫描仪(美国Perkin-Elmer公司)，在490 nm波长处对DOX的载药情况进行考察。同时，通过透析法考察给药系统在不同pH值(pH 5.5和pH 7.4)时释放DOX的情况。
1.8 给药系统细胞抑制率考察
HepG2细胞培养于10%胎牛血清及1%青链霉素双抗的RPMI-1640培养液中常规培养，细胞分为空白对照组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG组、PTT热疗组、DOX组、DOX联合PTT热疗组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX联合PTT热疗组、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向联合PTT热疗处理组。取对数生长期的HepG2细胞，以0.6×104个每孔接种到96孔板中。培养24 h后，空白对照组加入新鲜培养液，其他组分别加入对应制剂，每组设6个复孔。其中，每组中含有的DOX终浓度为5.2 mg/L(IC50浓度)，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG为8 mg/L。磁性靶向处理使用永磁铁放置于培养板下相应孔部位。近红外热疗组处理方法为加入制剂6 h后，使用808 nm波长的近红外激光照射，每孔照射2 min。继续培养48 h后弃去培养液，每孔加入新鲜配制的MTT溶液(0.5 g/L)，37 ℃孵育4 h，加入二甲基亚砜并振荡，通过酶标仪测定490 nm波长处的吸光度(OD)值，计算
各组HepG2细胞抑制率。以上过程重复3次。细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.9 统计学方法
数据应用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差±s)表示，数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。当P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CNTs载体的TEM及XRD分析
单纯CNTs的TEM结果显示，CNTs表面光滑，呈管状(图1A)。CNTs-Fe3O4-COOH的TEM与单纯CNTs相比，管壁表面出现了明显的纳米粒(图1B)。使用XRD法对CNTs-Fe3O4-COOH进行物质结构分析，结果显示在26.32°的2θ角处出现CNTs 002(JCPDS:41-1487)晶面的特征衍射峰，并且出现了220、311、400、422、511、440峰，均为Fe3O4的晶面特征衍射峰(JCPDS:19-0629)(图1C)。突厥语
2.2 给药系统的FT-IR光谱分析
FT-IR光谱结果表明CNTs(图2A)可被PEI及PEG共同功能化，且DOX可通过腙键被连接至CNTs表面。位于1 715 cm-1的-COOH特征峰表明CNTs已被成功羧基化(图2B)，568 cm-1的Fe-O特征峰表明Fe3O4已衍生至CNTs表面(图2C)。图2D中出现的C-N(1 108 cm-1)、N-H(1 635 cm-1,1 560 cm-1,3 450 cm-1)和C-H(2 924 cm-1)特征峰表明PEI修饰成功。以上结果表明CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX已成功合成。
2.3 给药系统的磁性分析
图3A和B中的水溶液明显不同，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX肿瘤靶向纳米药物递送系统在永磁铁的作用下迅速收拢至永磁铁范围内。磁滞曲线分析结果表明，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX的磁化强度为19.92 emu/g(图3C)。以上结果均证明该系统具有明显的磁性靶向作用。
2.4 给药系统的载药率及体外pH敏感释放分析
最终测定的DOX载药率为65.04%(WDOX：WCNTs-Fe3O4-PEI/PEG)。图4显示，在pH为5.5时，DOX的释放明显加快，终累计释放率高于80%，表明在120 h的考察期间DOX并没
有完全释放，这和DOX与CNTs表面结构的π-π堆积作用有一定的关系。在pH为7.4的环境中，DOX最终的累计释放率为18%。以上结果表明，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX具有明显的pH敏感控释特性。
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